دوره 32، شماره 3 - ( پاییز 1404 )
جلد 32 شماره 3 صفحات 208-196 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Research code: 6663
Ethics code: IR.BUMS.REC.1403.342
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Mesbah Mousavi A, Khorashadizadeh M, Zarban A, Chamani E. The effects of High and Low-PAD Score (Based on Phenolic level, Antioxidant level and Diastase activity) honey on Lactate Dehydrogenase (LDH) activity level and glucose consumption in 5-Fluorouracil Treated HT-29 Cells: An in vitro study. Journal of Translational Medical Research. 2025; 32 (3) :196-208
URL: http://journal.bums.ac.ir/article-1-3550-fa.html
URL: http://journal.bums.ac.ir/article-1-3550-fa.html
مصباح موسوی ارشیا، خراشادیزاده محسن، زربان اصغر، چمنی الهام. بررسی اثر عسل با PAD score (بر اساس سطح فنولی، سطح آنتیاکسیدانی و فعالیت دیاستازی) بالا و پایین بر سطح فعالیت آنزیم لاکتات دهیدروژناز و میزان مصرف گلوکز در سلولهای HT-29 تحت تیمار با 5-فلوئورویوراسیل: مطالعهای آزمایشگاهی (In vitro). تحقیقات پزشکی ترجمانی. 1404; 32 (3) :196-208
ارشیا مصباح موسوی1 
، محسن خراشادیزاده2 ، اصغر زربان3 ، الهام چمنی*4
، محسن خراشادیزاده2 ، اصغر زربان3 ، الهام چمنی*4
1- کمیته تحقیقات دانشجویی، دانشگاه علوم پزشکی بیرجند، بیرجند، ایران
2- مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی بیرجند، بیرجند، ایران و گروه بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی بیرجند، بیرجند، ایران
3- گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده پزشکی، مرکز تحقیقـات بیماریهای قلب و عروق، دانشگـاه علوم پزشکـی بیرجند، بیرجـند، ایـران
4- مرکز تحقیقات سلامت سالمندان، دانشگاه علوم پزشکی بیرجند، بیرجند، ایران ،chamani.elham@bums.ac.ir
2- مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی بیرجند، بیرجند، ایران و گروه بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی بیرجند، بیرجند، ایران
3- گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده پزشکی، مرکز تحقیقـات بیماریهای قلب و عروق، دانشگـاه علوم پزشکـی بیرجند، بیرجـند، ایـران
4- مرکز تحقیقات سلامت سالمندان، دانشگاه علوم پزشکی بیرجند، بیرجند، ایران ،
واژههای کلیدی: ۵-فلوئورویوراسیل (5-FU)، سرطان کولورکتال، سلولهای HT-29، عسل با PAD score بالا، عسل با PAD score پایین.
متن کامل [PDF 642 kb]
(128 دریافت)
| چکیده (HTML) (620 مشاهده)
شکل 1- مقایسه میزان زندهمانی سلولهای HT-29 در تیمار با 5-FU در محیط High Glc و Normal Glc:
گروه 1: 5-FU در محیط Normal Glc گروه 8: 5-FU در محیط High Glc
شکل 2- میزان زندهمانی سلولهای HT-29 در تیمار با عسل PAD score بالا و پایین بصورت مجزا در محیط Normal Glc:
گروه 4: عسل High-PAD score گروه 5: عسل Low-PAD score
شکل 3- میزان زندهمانی سلولهای HT-29 در تیمار با 5-FU بهصورت تک و ترکیبی با انواع مختلف عسل در محیط Normal Glc:
گروه 1: 5-FU گروه 2: عسل Low-PAD score + 5-FU گروه 3: عسل High-PAD score + 5-FU
شکل 4- مقایسه سطح LDH نرمال شده در گروههای مختلف
جدول 2- میزان گلوکز در محیط کشت حاوی عسل بدون سلول
بحث
سرطان کولورکتال یکی از شایعترین بدخیمیها در سطح جهان بوده و سومین علت مرگومیر ناشی از سرطان محسوب میشود. درمان با 5-فلورواوراسیل (5-FU) همچنان پایه اصلی شیمیدرمانی در این بیماران است و از طریق مهار آنزیم تیمیدین سنتتاز سنتز DNA را مختل میسازد. با وجود این، بروز مقاومت دارویی و کاهش پاسخ به 5-FU یکی از چالشهای عمده در مدیریت سرطان کولورکتال است، موضوعی که مطالعه حاضر در زمینه نقش شرایط متابولیکی و ترکیب با عوامل طبیعی از جمله عسل به بررسی آن پرداخته شده است (3, 17).
یافتههای این مطالعه نشان داد که محیط غنی از گلوکز مقاومت سلولهای سرطان کولورکتال HT-29 نسبت به داروی 5-FU را بهطور معناداری افزایش میدهد. میزان IC50 دارو در محیط High Glc به 110 میکرومولار رسید که در مقایسه با 50 میکرومولار در محیط Normal Glc اختلاف قابل توجهی دارد. این مشاهده نشان میدهد که هیپرگلیسمی میتواند بهعنوان یک عامل کلیدی در کاهش اثربخشی شیمیدرمانی عمل کند. Bergandi و همکاران گزارش کردند که در شرایط گلوکز بالا، تجمع داخلسلولی5-FU کاهش یافته و همراه با افت سطح گونههای اکسیژن فعال[5] (ROS)، پاسخ ضدتوموری دارو تضعیف میشود (18). همچنین Lu و همکاران نشان دادند که در سلولهای مقاوم به 5-FU، مسیرهای گلیکولیتیک (GLUT1، HK2، LDH-A) فعالتر میشوند و مهار این مسیرها حساسیت سلولها به دارو را بازمیگرداند (19).
از سوی دیگر، نتایج تیمار سلولها با عسل نشان داد که هر دو نوع عسل High-PAD score و Low-PAD score در غلظتهای 625/0 تا 10 درصد باعث کاهش معنادار زندهمانی سلولها شدند، اما این اثر در عسل High-PAD score بارزتر بود. این یافته با گزارشAfrin و همکاران همخوانی دارد که نشان دادند عسل مانوکا در ترکیب با5-FU موجب افزایش ROS، القای آپوپتوز و تغییر فنوتیپهای متابولیک میشود (20). Cianciosi و همکاران نیز بیان کردند که ترکیبات فنولی عسل میتوانند اثرات ضدتوموری داشته و در ترکیب با داروهای شیمیدرمانی بهطور سینرژیک عمل کنند (21). همچنین Waheed و همکاران نشان دادند که فلاونوئیدهایی مانند کوئرستین از طریق نفوذپذیری غشای خارجی میتوکندری(MOMP) مسیر آپوپتوز را در سلولهای HT-29 فعال میکنند (22). بنابراین میتوان گفت که کیفیت بیوشیمیایی عسل (ظرفیت فنولی و آنتیاکسیدانی) در تعیین شدت اثر ضدتوموری نقش اساسی دارد.
نتایج ما نشان داد که عسل Low-PAD score در غلظت پایین (%625/) تأثیری بر حساسیت سلولها به5-FU نداشت، در حالی که ترکیب5-FU با همان غلظت از عسل High-PAD score کاهش چشمگیر زندهمانی سلولها را رقم زد (0001/0>P). این اثر همافزایی با یافتههای Afrin و همکاران و Cianciosi و همکاران همسو است که نقش ترکیبات فنولی غنی را در تقویت پاسخ به5-FU تأیید کردهاند (20).
بررسی شاخص LDH نرمالشده نشان داد که در اغلب گروههای تیمارشده در محیط Normal Glc تفاوت معنیدار نسبت به کنترل وجود دارد (0001/0≥P) . این یافته بیانگر فعالشدن مسیرهای مرگ سلولی و آسیب غشایی است. عدم وجود تفاوت معنادار بین گروه سلولهای تیمار شده با 5-FU در محیط High Glc و گروه کنترل High Glc را میتوان ناشی از دو عامل دانست: کاهش تعداد سلولهای زنده و شرایط تنشزای متابولیکی که باعث تغییر در آزادسازی LDH میشود. مشابه این پدیده، Chan و همکاران تأکید کردهاند که سنجش LDH بهتنهایی نمیتواند تمایز دقیق آپوپتوز از نکروز را مشخص کند و باید همراه با آزمونهای مکمل مانند Annexin V/PI و فعالیت کاسپازها تفسیر شود (22). همچنین Fotakis وTimbrell نیز بر محدودیتهای LDH در شرایطی که تعداد سلولها کاهش مییابد تأکید کردند (23).
یافتههای ما نشان داد که مصرف گلوکز در گروه ترکیبی (5-FU + High-PAD score) بهطور معناداری بیشتر از گروه عسلHigh-PAD score بهتنهایی بود (05/0≥P). این موضوع میتواند نشاندهنده پاسخ متابولیکی تطابقی سلولها تحت درمان با 5-FU باشد. مطالعات نشان دادهاند که بازآرایی مسیرهای گلیکولیتیک در مقاومت به5-FU نقش مهمی دارد (24).Xiang و همکاران گزارش کردند که فعالسازی STAT3/HK2 باعث تقویت گلیکولیز و مقاومت به5-FU در سلولهای کولورکتال میشود (25). از سوی دیگر، Denise و همکاران نشان دادند که سلولهای مقاوم به5-FU بیشتر به OXPHOS وابسته میشوند و مصرف گلوکز در آنها کاهش مییابد (26). بنابراین افزایش مصرف گلوکز در گروه ترکیبی ما میتواند یک پاسخ حاد و گذرا به استرس ناشی از داروی 5-FU و استرس اکسیداتیو ناشی از حضور فنولهای عسل باشد، پیش از آنکه سلولها به سمت فاز پایدارتر مقاومت و وابستگی بهOXPHOS تغییر کنند.
نتیجهگیری
نتایج این مطالعه نشان داد که وجود گلوکز بالا مقاومت سلولهای HT-29 به داروی 5-FU را افزایش میدهد. عسل مورد استفاده در این مطالعه (عسل آپیزان، شرکت کاووش آریان آزما)، به ویژه عسل با PAD score بالا، توانست بهتنهایی اثرات ضدتوموری داشته و در ترکیب با 5-FU اثر همافزایی معنیداری ایجاد کند. همچنین شاخص LDH و الگوی مصرف گلوکز نشان دادند که تغییرات متابولیکی نقش مهمی در پاسخ سلولی به دارو دارند. این یافتهها پیشنهاد میکنند که ترکیب عوامل طبیعی با داروهای شیمیدرمانی میتواند رویکردی نویدبخش برای بهبود درمان سرطان کولورکتال باشد.
محدودیتهای مطالعه
از محدودیتهای این مطالعه، عدم گنجاندن گروه+ 5-FU عسل (PAD score بالا و پایین) در محیط High Glc و فقدان کنترلهای هماسمولار است؛ زیرا افزودن عسل در محیط با غلظت گلوکز بالا (High Glc) میتواند با افزایش بار قندی و تغییر اسمولاریته، بههمراه ویژگیهای ذاتی عسل(glucose oxidase، pH پایین)، متغیرهای مداخلهگر ایجاد کرده و تفسیر اختصاصی اثر PAD score را دشوار سازد. همچنین، اسمولاریته و گلوکز خارجسلولی بهطور پویشی پایش نشد و جزء پلیفنولیِ کمقند به صورت جداگانه آزمون نشد. این ملاحظات قابلیت تعمیم یافتهها را محدود میکند و ضرورتِ مطالعات تکمیلی با کنترلهای هماسمولار، سنجشهای بیوانرژتیک (میزان مصرف ATP) و بهکارگیری جزء پلیفنولیِ کمقند را برجسته میسازد. همچنین از محدودیتهای دیگر می توان به بررسی و استفاده از تنها یک رده سلولی سرطان کولورکتال، عدم بررسی مکانیزمهای دقیق مولکولی، عدم بررسی اثرات عسل و 5-FU در شرایط in vivo و عدم استفاده از روشهای چندگانه برای تعیین زندهمانی مثل آپوپتوز یا نکروز اشاره کرد. همچنین اثر قندهای منفرد عسل (گلوکز، فروکتوز، ساکاروز) بهطور جداگانه و با کنترلهای هماسمولار ارزیابی نشد؛ بنابراین یافتهها بازتابدهندهی اثر کل عسل است.
تقدیر و تشکّر
این مقاله حاصل طرح پژوهشی مصوب با کد 6663 میباشد. نویسندگان، مراتب تقدیر و تشکر خود را از حوزه معاونت تحقیقات و فناوری و آزمایشگاه جامع تحقیقات دانشگاه علوم پزشکی بیرجند اعلام میدارند.
ملاحظات اخلاقی
مطالعه حاضر پس از تأیید شورای پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی بیرجند و اخذ مجوز اخلاق با کد IR.BUMS.REC.1403.342 انجام شد.
حمایت مالی
این مطالعه با حمایت مالی دانشگاه علوم پزشکی بیرجند اجرا شده است.
مشارکت نویسندگان
مفهومسازی و طراحی مطالعه: الهام چمنی، محسن خراشادیزاده، اصغر زربان.
انجام آزمایشات: ارشیا مصباح موسوی.
تأمین منابع: الهام چمنی.
اعتبارسنجی دادهها: محسن خراشادیزاده و الهام چمنی.
نگارش – پیشنویس اولیه: ارشیا مصباح موسوی، الهام چمنی.
نگارش – بازنگری و ویرایش: الهام چمنی، محسن خراشادیزاده.
تأیید نهایی نسخهی آماده انتشار: اصغر زربان، محسن خراشادیزاده، الهام چمنی.
پاسخگویی در قبال صحت و تمامیت کار: ارشیا مصباح موسوی، الهام چمنی.
تضاد منافع
نویسندگان مقاله اعلام میدارند که هیچ گونه تضاد منافعی در پژوهش حاضر وجود ندارد.
متن کامل: (125 مشاهده)
مقدمه
سرطان کولورکتال[1] (CRC) یکی از بارزترین چالشهای سلامت عمومی در سطح جهان است و براساس آمارهای جهانی یکی از علل اصلی مرگومیر مرتبط با سرطان به شمار میرود (1). با وجود پیشرفتهای تشخیصی و درمانی، میزان عود و مرگومیر در گروهی از بیماران همچنان بالا بوده و نقطهضعف مهمی که موفقیت درمانی را محدود میسازد، پدیدۀ مقاومت دارویی است (2). 5-فلورواوراسیل (5-FU) بهعنوان پایه اصلی شیمیدرمانی در CRC شناخته میشود و در ترکیبهای استاندارد (مثل FOLFOX) به کار میرود؛ با این حال، طیف وسیعی از مکانیسمهای سلولی و مولکولی میتواند پاسخ به این دارو را کاهش دهد یا منجر به مقاومت اکتسابی گردد. مکانیسم اثر 5-FU عمدتاً از طریق مهار تیمیدیلات سنتاز و اختلال در سنتز DNA و RNA است که نهایتاً منجر به مهار تکثیر و القای مرگ سلولی میشود (3). با این وجود، سلولهای توموری میتوانند با تغییر مسیرهای بازسازی DNA، تنظیم بیان آنزیمهای هدف، تعدیل مسیرهای آپوپتوز، و نیز با تغییرات متابولیکی نسبت به این آسیبها مقاومت ایجاد کنند (4). در این میان، شواهد رو به افزایشی نشان میدهد که تغییرات متابولیکی ریزمحیط تومور نقش کلیدی در تنظیم حساسیت به دارو دارند؛ بهویژه هیپرگلیسمی یا افزایش دسترسی گلوکز در ریزمحیط توموری میتواند مسیرهای سیگنالینگ بقا را فعال و پاسخدهی به شیمیدرمانی را تضعیف کند (5).
یکی از شاخصترین ویژگیهای متابولیکی سلولهای سرطانی «اثر واربورگ[2]» است؛ پدیدهای که در آن سلولها حتی در حضور اکسیژن به استفاده غالب از مسیر گلیکولیز تمایل دارند. در این سازگاری متابولیک، آنزیم لاکتات دهیدروژناز ایزوفرم A[3] (LDH-A) نقشی کلیدی ایفا میکند؛ بهگونهای که با تبدیل پیرووات به لاکتات، شرایط لازم برای تداوم رشد و بقای سلولهای توموری را فراهم میسازد (6). شواهد بالینی و تجربی نشان دادهاند که افزایش بیان یا فعالیت LDH-A با پیشآگهی نامطلوب و بروز مقاومت دارویی در طیف وسیعی از سرطانها از جمله (CRC) مرتبط است (7). افزون بر این، دادههای اخیر حاکی از آن است که مسیرهای اپیژنتیکی و تنظیمات رونویسی ـ مانند محور METTL3/m6A ـ میتوانند موجب افزایش بیانLDH-A شده و بدینترتیب مقاومت دارویی را تقویت کنند. این گروه از سازگاریهای متابولیک، امروزه بهعنوان اهداف درمانی بالقوه و نویدبخش در سرطان مطرح شدهاند (8).
افزون بر نقشهای یادشده، غلظت گلوکز در ریزمحیط سلولی میتواند مسیرهای متعددی را تحتتأثیر قرار دهد. بهعنوان نمونه، هیپرگلیسمی از طریق فعالسازی فرایند اپیتلیالی–مزانشیم (EMT)، کاهش بیان E-cadherin و افزایش شاخصهایی نظیر vimentin و HMGA2، موجب افزایش توانایی مهاجرت و تهاجم سلولهای سرطانی شده و در مقابل، حساسیت آنها را نسبت به آپوپتوز و داروهای سیتوتوکسیک کاهش میدهد (9). علاوه بر این، فعالسازی محورهایی همچون Myc/SMAD3 و تقویت سیستمهای آنتیاکسیدانی در پاسخ به غلظت بالای گلوکز، از مکانیسمهای شناختهشده در ایجاد مقاومت دارویی بهشمار میرود (10). از سوی دیگر، ترکیبات طبیعی غنی از فنولها و آنتیاکسیدانها ـ نظیر برخی انواع عسل ـ در مطالعات پیشبالینی بهعنوان گزینههای مکمل مطرح شدهاند. شواهد حاصل از مطالعات in vitro نشان دادهاند که عسل میتواند از طریق کاهش تکثیر سلولی، القای آپوپتوز و مهار مسیرهای بقا و تهاجم همچون Wnt/β-catenin در مهار رشد تومور نقش داشته باشد. همچنین، در برخی بررسیها اثر همافزایی عسل با -FU5 گزارش شده است که به افزایش مرگ برنامهریزیشده سلولی و افزایش حساسیت به دارو منجر میشود (11). با این حال، باید توجه داشت که عسل یک ماتریس پیچیده است که علاوه بر ترکیبات فنولی، حاوی مقادیر قابلتوجهی قند نیز هست؛ ازاینرو در تفسیر نتایج پژوهشها ضروری است تغییرات ناشی از غلظت گلوکز محیطی و اثرات متابولیکی آن بهطور همزمان مد نظر قرار گیرند تا بتوان اثرات مفید بالقوه را از پیامدهای مرتبط با بار قندی عسل بهدرستی تفکیک نمود (9).
پارامتر ترکیبی [4]PAD بهعنوان شاخصی برای درجهبندی و پیشبینی اثرات زیستی عسل بهکار میرود. یافتههای زربان و همکاران نشان میدهد نمونههای High-PAD score (مثلاً عسل عناب) نسبت به Low-PAD score (مثلاً عسلهای تجاری) فنول، ظرفیت آنتیاکسیدانی و فعالیت دیاستازی (یکی از شاخصهای مهم در ارزیابی کیفیت عسل طبیعی) بیشتری دارند (تقریباً 606 µg GAE/mg در برابر 112؛ ≈203 µM/L در برابر ≈4.6؛ و ≈524 U/L در برابر ≈210) و در رده MCF-7 مهار رشد قویتر (IC₅₀ ≈170 در برابر ≈385 µg/mL)، کاهش مهاجرت و تعدیل بیان ژنهای Bax/p53/p21/Bcl-2 نشان میدهند (12). همچنین، در مدل حیوانی، مصرف «عسلهای قوی»ِ غنی از فنول و آنتیاکسیدان شاخص زخم معده را حدود 50درصد نسبت به عسلهای «ضعیف» کاهش دادند و شاخصهای اکسیداتیو/التهابی را بهبود بخشیدند (13). این دادهها از کارآمدی PAD برای طبقهبندی اثرات زیستی و ضدتوموری عسل حمایت میکند.
بر پایه شواهد مقدماتیِ حاکی از تشدید مقاومت دارویی در غلظتهای بالای گلوکز و گزارشهای همافزایی عسل با 5-FU، این پژوهش با هدف ارزیابی مقایسهای اثر عسلهای PAD-score بالا در برابر PAD-score پایین بر فعالیت LDH و میزان مصرف گلوکز در سلولهای HT-29 تحت تیمار 5-FU طراحی شد؛ همچنین شرایط کشت با گلوکزِ بالا (High Glc) بهمنزله وضعیت مقایسهای در نظر گرفته شد. فرضیه ی ما این است که عسلهای PAD-score بالا از طریق تعدیل متابولیسم گلوکز و افزایش استرس متابولیک (حالتی که در آن تعادل متابولیکی سلول بههم میخورد و تولید و مصرف انرژی، مواد مغذی، یا متابولیتها دیگر در حالت ناپایدار قرار می گیرد)، حساسیت به 5-FU را بیش از عسلهای PAD-score پایین افزایش میدهند؛ به شرط اینکه تفسیر نتایج پس از نرمالسازی اثر قندِ افزوده عسل انجام شود.
روش تحقیق
مواد و تجهیزات
HT-29 (انستیتو پاستور ایران، تهران)؛ DMEM (Biosera, France)؛ FBS ده درصد (Biosera, France)؛ پنیسیلین/استرپتومایسین یک درصد (Biosera, France)؛ PBS (Biosera, France)؛ تریپسین–EDTA (Biosera, France)؛ 5-Fluorouracil; 5-FU (Sigma-Aldrich, USA)؛ نمونههای عسل با PAD-score High و Low (عسل آپیزان، شرکت کاووش آریان آزما)؛ کیت سنجش گلوکز GOD-POD (Pars Azmun, Iran)؛ کیت سنجش فعالیت LDH (Pars Azmun, Iran)؛ معرف MTT (Sigma-Aldrich, USA)؛ DMSO (Merck, Germany).
آمادهسازی و کنترل کیفیت رده سلولی
کریوویالهای حاوی رده سلولی HT-29 در شرایط استریل و با افزودن تدریجی محیط کشت کامل (دمای 37 درجه سانتیگراد) یخ زدایی شدند. سپس، سلولها به فلاسکهای کشت منتقل و در انکوباتور (دمای 37 درجه سانتیگراد، %5CO₂، رطوبت %95) کشت داده شدند. سلولها حداقل سه بار پاساژ داده شدند و تنها در صورتی برای آزمایش استفاده شدند که درصد بقای آنها ≥%80 بود. آزمایشهای کنترل آلودگی (میکروبی، قارچی و مایکوپلاسما) پیش از شروع آزمایشها انجام شد. تمام مراحل در شرایط استریل و زیر هود لامینار با استفاده از تجهیزات استریل انجام گرفت.
آمادهسازی نمونههای عسل
در ابتدا استوکی از نمونههای عسل با غلظت 10% در محیط کشت DMEM حل شد. برای حذف آلودگی میکروبی، محلولهای عسل ابتدا در محیط کشت گرمشده (37 درجه سانتیگراد) مخلوط و سپس با فیلتر 22/0 میکرومتری استریل شد. در مرحله بعد از استوک اولیه، غلظتهای 10%، 5%، 5/2%، 25/1% و 625/0% تهیه شد و جهت بررسی اثر بر سلولها مورد استفاده قرار گرفت.
نمونهها به دو دسته عسل طبیعیHigh-PAD score و عسل تجاری Low-PAD score طبقهبندی شدند. معیار فعالیت آنتیاکسیدانی (PAD) نمونهها، مقادیر اعلامی توسط تأمین کننده بود.
طراحی آزمایش و تیمارها
آزمایش شامل هشت گروه به شرح زیر (جدول 1) بود:
سرطان کولورکتال[1] (CRC) یکی از بارزترین چالشهای سلامت عمومی در سطح جهان است و براساس آمارهای جهانی یکی از علل اصلی مرگومیر مرتبط با سرطان به شمار میرود (1). با وجود پیشرفتهای تشخیصی و درمانی، میزان عود و مرگومیر در گروهی از بیماران همچنان بالا بوده و نقطهضعف مهمی که موفقیت درمانی را محدود میسازد، پدیدۀ مقاومت دارویی است (2). 5-فلورواوراسیل (5-FU) بهعنوان پایه اصلی شیمیدرمانی در CRC شناخته میشود و در ترکیبهای استاندارد (مثل FOLFOX) به کار میرود؛ با این حال، طیف وسیعی از مکانیسمهای سلولی و مولکولی میتواند پاسخ به این دارو را کاهش دهد یا منجر به مقاومت اکتسابی گردد. مکانیسم اثر 5-FU عمدتاً از طریق مهار تیمیدیلات سنتاز و اختلال در سنتز DNA و RNA است که نهایتاً منجر به مهار تکثیر و القای مرگ سلولی میشود (3). با این وجود، سلولهای توموری میتوانند با تغییر مسیرهای بازسازی DNA، تنظیم بیان آنزیمهای هدف، تعدیل مسیرهای آپوپتوز، و نیز با تغییرات متابولیکی نسبت به این آسیبها مقاومت ایجاد کنند (4). در این میان، شواهد رو به افزایشی نشان میدهد که تغییرات متابولیکی ریزمحیط تومور نقش کلیدی در تنظیم حساسیت به دارو دارند؛ بهویژه هیپرگلیسمی یا افزایش دسترسی گلوکز در ریزمحیط توموری میتواند مسیرهای سیگنالینگ بقا را فعال و پاسخدهی به شیمیدرمانی را تضعیف کند (5).
یکی از شاخصترین ویژگیهای متابولیکی سلولهای سرطانی «اثر واربورگ[2]» است؛ پدیدهای که در آن سلولها حتی در حضور اکسیژن به استفاده غالب از مسیر گلیکولیز تمایل دارند. در این سازگاری متابولیک، آنزیم لاکتات دهیدروژناز ایزوفرم A[3] (LDH-A) نقشی کلیدی ایفا میکند؛ بهگونهای که با تبدیل پیرووات به لاکتات، شرایط لازم برای تداوم رشد و بقای سلولهای توموری را فراهم میسازد (6). شواهد بالینی و تجربی نشان دادهاند که افزایش بیان یا فعالیت LDH-A با پیشآگهی نامطلوب و بروز مقاومت دارویی در طیف وسیعی از سرطانها از جمله (CRC) مرتبط است (7). افزون بر این، دادههای اخیر حاکی از آن است که مسیرهای اپیژنتیکی و تنظیمات رونویسی ـ مانند محور METTL3/m6A ـ میتوانند موجب افزایش بیانLDH-A شده و بدینترتیب مقاومت دارویی را تقویت کنند. این گروه از سازگاریهای متابولیک، امروزه بهعنوان اهداف درمانی بالقوه و نویدبخش در سرطان مطرح شدهاند (8).
افزون بر نقشهای یادشده، غلظت گلوکز در ریزمحیط سلولی میتواند مسیرهای متعددی را تحتتأثیر قرار دهد. بهعنوان نمونه، هیپرگلیسمی از طریق فعالسازی فرایند اپیتلیالی–مزانشیم (EMT)، کاهش بیان E-cadherin و افزایش شاخصهایی نظیر vimentin و HMGA2، موجب افزایش توانایی مهاجرت و تهاجم سلولهای سرطانی شده و در مقابل، حساسیت آنها را نسبت به آپوپتوز و داروهای سیتوتوکسیک کاهش میدهد (9). علاوه بر این، فعالسازی محورهایی همچون Myc/SMAD3 و تقویت سیستمهای آنتیاکسیدانی در پاسخ به غلظت بالای گلوکز، از مکانیسمهای شناختهشده در ایجاد مقاومت دارویی بهشمار میرود (10). از سوی دیگر، ترکیبات طبیعی غنی از فنولها و آنتیاکسیدانها ـ نظیر برخی انواع عسل ـ در مطالعات پیشبالینی بهعنوان گزینههای مکمل مطرح شدهاند. شواهد حاصل از مطالعات in vitro نشان دادهاند که عسل میتواند از طریق کاهش تکثیر سلولی، القای آپوپتوز و مهار مسیرهای بقا و تهاجم همچون Wnt/β-catenin در مهار رشد تومور نقش داشته باشد. همچنین، در برخی بررسیها اثر همافزایی عسل با -FU5 گزارش شده است که به افزایش مرگ برنامهریزیشده سلولی و افزایش حساسیت به دارو منجر میشود (11). با این حال، باید توجه داشت که عسل یک ماتریس پیچیده است که علاوه بر ترکیبات فنولی، حاوی مقادیر قابلتوجهی قند نیز هست؛ ازاینرو در تفسیر نتایج پژوهشها ضروری است تغییرات ناشی از غلظت گلوکز محیطی و اثرات متابولیکی آن بهطور همزمان مد نظر قرار گیرند تا بتوان اثرات مفید بالقوه را از پیامدهای مرتبط با بار قندی عسل بهدرستی تفکیک نمود (9).
پارامتر ترکیبی [4]PAD بهعنوان شاخصی برای درجهبندی و پیشبینی اثرات زیستی عسل بهکار میرود. یافتههای زربان و همکاران نشان میدهد نمونههای High-PAD score (مثلاً عسل عناب) نسبت به Low-PAD score (مثلاً عسلهای تجاری) فنول، ظرفیت آنتیاکسیدانی و فعالیت دیاستازی (یکی از شاخصهای مهم در ارزیابی کیفیت عسل طبیعی) بیشتری دارند (تقریباً 606 µg GAE/mg در برابر 112؛ ≈203 µM/L در برابر ≈4.6؛ و ≈524 U/L در برابر ≈210) و در رده MCF-7 مهار رشد قویتر (IC₅₀ ≈170 در برابر ≈385 µg/mL)، کاهش مهاجرت و تعدیل بیان ژنهای Bax/p53/p21/Bcl-2 نشان میدهند (12). همچنین، در مدل حیوانی، مصرف «عسلهای قوی»ِ غنی از فنول و آنتیاکسیدان شاخص زخم معده را حدود 50درصد نسبت به عسلهای «ضعیف» کاهش دادند و شاخصهای اکسیداتیو/التهابی را بهبود بخشیدند (13). این دادهها از کارآمدی PAD برای طبقهبندی اثرات زیستی و ضدتوموری عسل حمایت میکند.
بر پایه شواهد مقدماتیِ حاکی از تشدید مقاومت دارویی در غلظتهای بالای گلوکز و گزارشهای همافزایی عسل با 5-FU، این پژوهش با هدف ارزیابی مقایسهای اثر عسلهای PAD-score بالا در برابر PAD-score پایین بر فعالیت LDH و میزان مصرف گلوکز در سلولهای HT-29 تحت تیمار 5-FU طراحی شد؛ همچنین شرایط کشت با گلوکزِ بالا (High Glc) بهمنزله وضعیت مقایسهای در نظر گرفته شد. فرضیه ی ما این است که عسلهای PAD-score بالا از طریق تعدیل متابولیسم گلوکز و افزایش استرس متابولیک (حالتی که در آن تعادل متابولیکی سلول بههم میخورد و تولید و مصرف انرژی، مواد مغذی، یا متابولیتها دیگر در حالت ناپایدار قرار می گیرد)، حساسیت به 5-FU را بیش از عسلهای PAD-score پایین افزایش میدهند؛ به شرط اینکه تفسیر نتایج پس از نرمالسازی اثر قندِ افزوده عسل انجام شود.
روش تحقیق
مواد و تجهیزات
HT-29 (انستیتو پاستور ایران، تهران)؛ DMEM (Biosera, France)؛ FBS ده درصد (Biosera, France)؛ پنیسیلین/استرپتومایسین یک درصد (Biosera, France)؛ PBS (Biosera, France)؛ تریپسین–EDTA (Biosera, France)؛ 5-Fluorouracil; 5-FU (Sigma-Aldrich, USA)؛ نمونههای عسل با PAD-score High و Low (عسل آپیزان، شرکت کاووش آریان آزما)؛ کیت سنجش گلوکز GOD-POD (Pars Azmun, Iran)؛ کیت سنجش فعالیت LDH (Pars Azmun, Iran)؛ معرف MTT (Sigma-Aldrich, USA)؛ DMSO (Merck, Germany).
آمادهسازی و کنترل کیفیت رده سلولی
کریوویالهای حاوی رده سلولی HT-29 در شرایط استریل و با افزودن تدریجی محیط کشت کامل (دمای 37 درجه سانتیگراد) یخ زدایی شدند. سپس، سلولها به فلاسکهای کشت منتقل و در انکوباتور (دمای 37 درجه سانتیگراد، %5CO₂، رطوبت %95) کشت داده شدند. سلولها حداقل سه بار پاساژ داده شدند و تنها در صورتی برای آزمایش استفاده شدند که درصد بقای آنها ≥%80 بود. آزمایشهای کنترل آلودگی (میکروبی، قارچی و مایکوپلاسما) پیش از شروع آزمایشها انجام شد. تمام مراحل در شرایط استریل و زیر هود لامینار با استفاده از تجهیزات استریل انجام گرفت.
آمادهسازی نمونههای عسل
در ابتدا استوکی از نمونههای عسل با غلظت 10% در محیط کشت DMEM حل شد. برای حذف آلودگی میکروبی، محلولهای عسل ابتدا در محیط کشت گرمشده (37 درجه سانتیگراد) مخلوط و سپس با فیلتر 22/0 میکرومتری استریل شد. در مرحله بعد از استوک اولیه، غلظتهای 10%، 5%، 5/2%، 25/1% و 625/0% تهیه شد و جهت بررسی اثر بر سلولها مورد استفاده قرار گرفت.
نمونهها به دو دسته عسل طبیعیHigh-PAD score و عسل تجاری Low-PAD score طبقهبندی شدند. معیار فعالیت آنتیاکسیدانی (PAD) نمونهها، مقادیر اعلامی توسط تأمین کننده بود.
طراحی آزمایش و تیمارها
آزمایش شامل هشت گروه به شرح زیر (جدول 1) بود:
جدول 1 – شرح گروههای سلولی مورد آزمایش بر اساس 5-FU، عسل PAD score پایین/بالا و سطح گلوکز
| شماره گروه | نوع گروه |
| 1 | محیطNormal Glc + 5-FU |
| 2 | محیط Normal Glc + 5-FU + عسل Low-PAD score |
| 3 | محیط Normal Glc + 5-FU + عسل High-PAD score |
| 4 | محیط Normal Glc + عسل High-PAD score |
| 5 | محیط Normal Glc + عسل Low-PAD score |
| 6 | محیط Normal Glc بدون تیمار (کنترل) |
| 7 | محیط High Glc بدون تیمار (کنترل) |
| 8 | محیط High Glc + 5-FU |
انتخاب غلظتهای عسل
برای بررسی اثر ترکیبی، از غلظت زیرسیتوتوکسیک 0.625% عسل در ترکیب با 5-FU استفاده شد. برای ارزیابی اثر مستقل عسل، غلظت 2.5% (IC50 عسل) انتخاب شد که بر اساس آزمونهای پیشآزمایشی و منحنی دز–پاسخ تعیین شده بود.
میزان غلظت گلوکز در محیط کشت Normal Glc برابر 100 mg/dL و در محیط کشت High Glc برابر با 450 mg/dL میباشد.
آزمون MTT برای سنجش بقای سلولی و استخراج IC50
آزمایش MTT در پلیتهای 96 خانه با تعداد 10،000 سلول در هر خانه انجام شد. پس از 24 ساعت تثبیت سلولها، تیمارها (5-FU، عسل یا ترکیب آنها) انجام شدند. مدت زمان تیمار 72 ساعت بود.
پس از افزودن محلول MTT (غلظت نهایی 5/0میلیگرم بر میلیلیتر) و انکوباسیون به مدت 3 تا 4 ساعت، فرمازان تشکیلشده با افزودن DMSO حل شد و جذب نوری در طول موج 540-570 نانومتر اندازهگیری شد. درصد بقای سلولی با فرمول زیر محاسبه شد:
بقای سلولی = )جذب نمونه / جذب کنترل 100×(
منحنی دز–پاسخ با استفاده از نرمافزار GraphPad Prism رسم و مقدار IC50 استخراج شد. هر آزمایش در سه تکرار انجام شد.
سنجش مصرف گلوکز محیط
در هر خانه از پلیتهای 6 خانه، تعداد 500,000 سلول کشت شد. پس از 24 ساعت انکوباسیون، تیمارها اعمال گردید و 72 ساعت بعد، محیطِ رویی جمعآوری شد. غلظت گلوکزِ محیط در زمان شروع و پایان تیمار با استفاده از کیت سنجش گلوکز (بر پایه روش آنزیمی گلوکز اکسیداز–پراکسیداز) و اتوآنالایزر اندازهگیری شد. بهمنظور حذف سیگنال زمینه ناشی از عسل، براساس روشی که در پایان نامه خود با کد 456915، ستآپ و اعتبارسنجی کردیم، برای هر شرایط، بلانکِ «محیط + عسل بدون سلول» که دقیقاً همان تیمارها را دریافت کرده بود، بهصورت موازی سنجش شد (14-16). مقادیر گلوکز مصرفشده با فرمول زیر نرمالسازی شدند:
برای بررسی اثر ترکیبی، از غلظت زیرسیتوتوکسیک 0.625% عسل در ترکیب با 5-FU استفاده شد. برای ارزیابی اثر مستقل عسل، غلظت 2.5% (IC50 عسل) انتخاب شد که بر اساس آزمونهای پیشآزمایشی و منحنی دز–پاسخ تعیین شده بود.
میزان غلظت گلوکز در محیط کشت Normal Glc برابر 100 mg/dL و در محیط کشت High Glc برابر با 450 mg/dL میباشد.
آزمون MTT برای سنجش بقای سلولی و استخراج IC50
آزمایش MTT در پلیتهای 96 خانه با تعداد 10،000 سلول در هر خانه انجام شد. پس از 24 ساعت تثبیت سلولها، تیمارها (5-FU، عسل یا ترکیب آنها) انجام شدند. مدت زمان تیمار 72 ساعت بود.
پس از افزودن محلول MTT (غلظت نهایی 5/0میلیگرم بر میلیلیتر) و انکوباسیون به مدت 3 تا 4 ساعت، فرمازان تشکیلشده با افزودن DMSO حل شد و جذب نوری در طول موج 540-570 نانومتر اندازهگیری شد. درصد بقای سلولی با فرمول زیر محاسبه شد:
بقای سلولی = )جذب نمونه / جذب کنترل 100×(
منحنی دز–پاسخ با استفاده از نرمافزار GraphPad Prism رسم و مقدار IC50 استخراج شد. هر آزمایش در سه تکرار انجام شد.
سنجش مصرف گلوکز محیط
در هر خانه از پلیتهای 6 خانه، تعداد 500,000 سلول کشت شد. پس از 24 ساعت انکوباسیون، تیمارها اعمال گردید و 72 ساعت بعد، محیطِ رویی جمعآوری شد. غلظت گلوکزِ محیط در زمان شروع و پایان تیمار با استفاده از کیت سنجش گلوکز (بر پایه روش آنزیمی گلوکز اکسیداز–پراکسیداز) و اتوآنالایزر اندازهگیری شد. بهمنظور حذف سیگنال زمینه ناشی از عسل، براساس روشی که در پایان نامه خود با کد 456915، ستآپ و اعتبارسنجی کردیم، برای هر شرایط، بلانکِ «محیط + عسل بدون سلول» که دقیقاً همان تیمارها را دریافت کرده بود، بهصورت موازی سنجش شد (14-16). مقادیر گلوکز مصرفشده با فرمول زیر نرمالسازی شدند:
Glu مصرفی نرمال شده = (Glu ابتدایی− Glu پس از 72h) − Glu محیط+عسل (بدون سلول)
دادههای گزارششده بر اساس این نرمالسازی محاسبه شدند.
سنجش فعالیت LDH
بهمنظور اندارهگیری سطح فعالیت آنزیم (LDH)، به هر چاهک یک میلیلیتر تریپسین افزوده شد و پس از جدا شدن سلولها، با محیط کامل (حاوی سرم) اثر تریپسین خنثی گردید. سلولها به مدت 5 دقیقه در RPM 1200 سانتریفیوژ شدند، سپس مایع رویی حذف و رسوب سلولی با 4 میلیلیتر PBS شستوشو داده شد. این مرحله یک بار دیگر تکرار گردید و در نهایت سلولها در 500 میکرولیتر PBS سوسپانسیون شده و به میکروتیوبهای 5/1 میلیلیتری منتقل شدند. نمونهها در سانتریفیوژ یخچالدار با دور g 12000 به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شدند. پس از جداسازی مایع رویی، سلولها دو بار (هر بار 10 ثانیه با فاصله چند ثانیهای) سونیکیت گردیدند. لیزات سلولی با کیت تجاری و روش اسپکتروفوتومتریک (طول موج مطابق دستورالعمل کیت) اندازهگیری شد.
دادهها با شاخص نرمالشده زیر گزارش شدند:
سنجش فعالیت LDH
بهمنظور اندارهگیری سطح فعالیت آنزیم (LDH)، به هر چاهک یک میلیلیتر تریپسین افزوده شد و پس از جدا شدن سلولها، با محیط کامل (حاوی سرم) اثر تریپسین خنثی گردید. سلولها به مدت 5 دقیقه در RPM 1200 سانتریفیوژ شدند، سپس مایع رویی حذف و رسوب سلولی با 4 میلیلیتر PBS شستوشو داده شد. این مرحله یک بار دیگر تکرار گردید و در نهایت سلولها در 500 میکرولیتر PBS سوسپانسیون شده و به میکروتیوبهای 5/1 میلیلیتری منتقل شدند. نمونهها در سانتریفیوژ یخچالدار با دور g 12000 به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شدند. پس از جداسازی مایع رویی، سلولها دو بار (هر بار 10 ثانیه با فاصله چند ثانیهای) سونیکیت گردیدند. لیزات سلولی با کیت تجاری و روش اسپکتروفوتومتریک (طول موج مطابق دستورالعمل کیت) اندازهگیری شد.
دادهها با شاخص نرمالشده زیر گزارش شدند:
LDH index (نرمال شده) = LDH داخل سلول/ LDHداخل + خارج سلول
این شاخص امکان مقایسه دقیقتر بین گروهها را فراهم کرد.
تحلیل آماری
دادهها بهصورت میانگین±انحراف معیار (Mean±SD) گزارش شدند. مقایسههای چندگروهی با آزمون ANOVA یکطرفه انجام شد. مقایسههای دوگروهی با آزمون t مستقل تحلیل شدند. نرمافزار GraphPad Prism نسخه 9 استفاده شد و آستانه معناداری 05/0>P در نظر گرفته شد.
یافتهها
میزان زندهمانی سلولهای HT-29 تیمار شده با 5-FU در محیط Normal Glc و High Glc
شکل یک روند کاهشی میزان زندهمانی سلولهای HT-29 را با افزایش غلظت 5-FU نشان میدهد. همانطورکه مشخص است، میزان IC50 برای 5-FU در محیط High Glc برابر 110 میکرومولار میباشد که نسبت به محیط Normal Glc (IC50 5-FU = 50 µM) افزایش چشمگیری داشته است. میزان زندهمانی بین گروه 1 و 8 با یکدیگر و همچنین در مقایسه با گروه کنترل دارای تفاوت معناداری (001/0>P) میباشد.
میزان زندهمانی سلولهای HT-29 تیمار شده با عسلHigh-PAD score و Low-PAD score در محیط Normal GlC
همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، تیمار سلولهای HT-29 با هر دو عسل High-PAD score و Low-PADscore در دامنه غلظتی 10-625/0 درصد نسبت به گروه کنترل باعث ایجاد تفاوت معنیداری در میزان زندهمانی سلولها شده است. این در حالی است که در غلظتهای 5/2 و 5 درصد بین سلولهای تیمار شده با عسل High-PAD score و Low-PAD score تفاوت معنیداری مشاهده شد؛ به گونهای که عسل High-PADscore در هر دو غلظت منجر به کاهش بیشتری در میزان زندهمانی سلولها شده است.
بررسی میزان زندهمانی سلولهای HT-29 تیمار شده با درمان ترکیبی 5-FU و عسل High-PAD score و عسل Low-PAD sore
میزان IC50 برای 5-FU در محیط Normal Glc برابر 50 میکرومولار میباشد ( شکل 3). این در حالی است که تیمار همزمان سلولها با 5-FU و 625/0 درصد عسل High-PAD score و Low-PAD score سبب کاهش معنیدار میزان IC50 تا 25 میکرومولار شد که نسبت به تیمار سلولها با 5-FU به تنهایی معنیدار بود (001/0>P)( شکل 3).
تحلیل آماری
دادهها بهصورت میانگین±انحراف معیار (Mean±SD) گزارش شدند. مقایسههای چندگروهی با آزمون ANOVA یکطرفه انجام شد. مقایسههای دوگروهی با آزمون t مستقل تحلیل شدند. نرمافزار GraphPad Prism نسخه 9 استفاده شد و آستانه معناداری 05/0>P در نظر گرفته شد.
یافتهها
میزان زندهمانی سلولهای HT-29 تیمار شده با 5-FU در محیط Normal Glc و High Glc
شکل یک روند کاهشی میزان زندهمانی سلولهای HT-29 را با افزایش غلظت 5-FU نشان میدهد. همانطورکه مشخص است، میزان IC50 برای 5-FU در محیط High Glc برابر 110 میکرومولار میباشد که نسبت به محیط Normal Glc (IC50 5-FU = 50 µM) افزایش چشمگیری داشته است. میزان زندهمانی بین گروه 1 و 8 با یکدیگر و همچنین در مقایسه با گروه کنترل دارای تفاوت معناداری (001/0>P) میباشد.
میزان زندهمانی سلولهای HT-29 تیمار شده با عسلHigh-PAD score و Low-PAD score در محیط Normal GlC
همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، تیمار سلولهای HT-29 با هر دو عسل High-PAD score و Low-PADscore در دامنه غلظتی 10-625/0 درصد نسبت به گروه کنترل باعث ایجاد تفاوت معنیداری در میزان زندهمانی سلولها شده است. این در حالی است که در غلظتهای 5/2 و 5 درصد بین سلولهای تیمار شده با عسل High-PAD score و Low-PAD score تفاوت معنیداری مشاهده شد؛ به گونهای که عسل High-PADscore در هر دو غلظت منجر به کاهش بیشتری در میزان زندهمانی سلولها شده است.
بررسی میزان زندهمانی سلولهای HT-29 تیمار شده با درمان ترکیبی 5-FU و عسل High-PAD score و عسل Low-PAD sore
میزان IC50 برای 5-FU در محیط Normal Glc برابر 50 میکرومولار میباشد ( شکل 3). این در حالی است که تیمار همزمان سلولها با 5-FU و 625/0 درصد عسل High-PAD score و Low-PAD score سبب کاهش معنیدار میزان IC50 تا 25 میکرومولار شد که نسبت به تیمار سلولها با 5-FU به تنهایی معنیدار بود (001/0>P)( شکل 3).
شکل 1- مقایسه میزان زندهمانی سلولهای HT-29 در تیمار با 5-FU در محیط High Glc و Normal Glc:
گروه 1: 5-FU در محیط Normal Glc گروه 8: 5-FU در محیط High Glc
شکل 2- میزان زندهمانی سلولهای HT-29 در تیمار با عسل PAD score بالا و پایین بصورت مجزا در محیط Normal Glc:
گروه 4: عسل High-PAD score گروه 5: عسل Low-PAD score
شکل 3- میزان زندهمانی سلولهای HT-29 در تیمار با 5-FU بهصورت تک و ترکیبی با انواع مختلف عسل در محیط Normal Glc:
گروه 1: 5-FU گروه 2: عسل Low-PAD score + 5-FU گروه 3: عسل High-PAD score + 5-FU
بررسی فعالیت آنزیم LDH در سلولهای HT-29 تیمار شده با درمان ترکیبی 5-FU و عسل High-PAD score و عسل Low-PAD sore
به منظور ارزیابی بقا و آسیب سلولی، از شاخص LDH نرمالشده (نسبت LDH داخلسلولی به مجموع داخل و خارجسلولی) استفاده شد.
در شکل 4، سطح LDH نرمالشده داخل سلولی در گروههای مختلف تیمار شده نشان داده شده است. بین گروههای مختلف در محیط Normal Glc و گروه کنترل Normal Glc تفاوت معنیدار در سطح LDH وجود دارد (0001/0>P).
بررسی میزان مصرف گلوکز در سلولهای HT-29 تیمار شده با درمان ترکیبی 5-FU و عسل High-PAD score و عسل Low-PAD sore
به منظور ارزیابی میزان مصرف گلوکز توسط سلولها مقدار گلوکزِ اولیه و باقیمانده در محیط پس از نرمالسازی اثر قندِ عسل استفاده شد.
برای نرمالسازی میزان گلوکز و حذف اثر افزایش قند ناشی از افزودن عسل به محیط کشت مقادیر گلوکز را درحالتهای زیر نیز محاسبه کردیم (جدول 2):
به منظور ارزیابی بقا و آسیب سلولی، از شاخص LDH نرمالشده (نسبت LDH داخلسلولی به مجموع داخل و خارجسلولی) استفاده شد.
در شکل 4، سطح LDH نرمالشده داخل سلولی در گروههای مختلف تیمار شده نشان داده شده است. بین گروههای مختلف در محیط Normal Glc و گروه کنترل Normal Glc تفاوت معنیدار در سطح LDH وجود دارد (0001/0>P).
بررسی میزان مصرف گلوکز در سلولهای HT-29 تیمار شده با درمان ترکیبی 5-FU و عسل High-PAD score و عسل Low-PAD sore
به منظور ارزیابی میزان مصرف گلوکز توسط سلولها مقدار گلوکزِ اولیه و باقیمانده در محیط پس از نرمالسازی اثر قندِ عسل استفاده شد.
برای نرمالسازی میزان گلوکز و حذف اثر افزایش قند ناشی از افزودن عسل به محیط کشت مقادیر گلوکز را درحالتهای زیر نیز محاسبه کردیم (جدول 2):
شکل 4- مقایسه سطح LDH نرمال شده در گروههای مختلف
جدول 2- میزان گلوکز در محیط کشت حاوی عسل بدون سلول
| عنوان | میزان گلوکز mg/dl |
| عسل Low-PAD score با غلظت 5/2% در محیط Normal Glu | 959 ± 7 |
| عسل Low-PAD score با غلظت 625/0% در محیط Normal Glu | 378 ± 8/2 |
| عسل High-PAD score با غلظت 5/2% در محیط Normal Glu | 837 ± 8/9 |
| عسل High-PAD score با غلظت 625/0% در محیط Normal Glu | 5/276 ± 7/0 |
همانطور که مشخص است (جدول3)، تفاوت معناداری (05/0>P) بین گروه 3 (5-FU + عسل High-PAD score) با گروه 4 (عسل High-PAD score) در میزان گلوکز محیط رویی وجود دارد. این تفاوت نشان دهنده این است که سلولها وقتی تحت تیمار ترکیبی قرار میگیرند (گروه 3) میزان بیشتری گلوکز مصرف میکنند نسبت به زمانی که تحت تیمار با 5-FU یا عسل بهطور مجزّا و تکی قرار میگیرند.
در نهایت دادههای اولیه ما پس از نرمالسازی بهصورت زیر تبدیل شدند:
در نهایت دادههای اولیه ما پس از نرمالسازی بهصورت زیر تبدیل شدند:
جدول 3- دادههای نهایی نرمالشده گلوکز
| شماره گروه تیمار | نوع گروه تیمار | میزان اولیه گلوکز mg/dl | میزان نرمالشده گلوکز mg/dl |
| 1 | محیطNormal Glc + 5-FU | 5/58 ± 7/0 | 5/58 ± 7/0 |
| 2 | محیط Normal Glc + 5-FU + عسل Low-PAD score | 343 ± 414/1 | 35 ± 24/4 |
| 3 | محیط Normal Glc + 5-FU + عسل High-PAD score | 5/266± 7071/0 | 10 ± 41/1 |
| 4 | محیط Normal Glc + عسل High-PAD score | 757 ± 657/5 | 80 ± 24/4 |
| 5 | محیط Normal Glc + عسل Low-PAD score | 879 ± 08/48 | 80 ± 01/41 |
| 6 | محیط Normal Glc بدون تیمار (کنترل) | 71 ± 41/1 | 71 ± 41/1 |
| 7 | محیط High Glc بدون تیمار (کنترل) | 5/298 ± 53/3 | 5/298 ± 53/3 |
| 8 | محیط High Glc + 5-FU | 5/374 ± 77/7 | 5/374 ± 77/7 |
بحث
سرطان کولورکتال یکی از شایعترین بدخیمیها در سطح جهان بوده و سومین علت مرگومیر ناشی از سرطان محسوب میشود. درمان با 5-فلورواوراسیل (5-FU) همچنان پایه اصلی شیمیدرمانی در این بیماران است و از طریق مهار آنزیم تیمیدین سنتتاز سنتز DNA را مختل میسازد. با وجود این، بروز مقاومت دارویی و کاهش پاسخ به 5-FU یکی از چالشهای عمده در مدیریت سرطان کولورکتال است، موضوعی که مطالعه حاضر در زمینه نقش شرایط متابولیکی و ترکیب با عوامل طبیعی از جمله عسل به بررسی آن پرداخته شده است (3, 17).
یافتههای این مطالعه نشان داد که محیط غنی از گلوکز مقاومت سلولهای سرطان کولورکتال HT-29 نسبت به داروی 5-FU را بهطور معناداری افزایش میدهد. میزان IC50 دارو در محیط High Glc به 110 میکرومولار رسید که در مقایسه با 50 میکرومولار در محیط Normal Glc اختلاف قابل توجهی دارد. این مشاهده نشان میدهد که هیپرگلیسمی میتواند بهعنوان یک عامل کلیدی در کاهش اثربخشی شیمیدرمانی عمل کند. Bergandi و همکاران گزارش کردند که در شرایط گلوکز بالا، تجمع داخلسلولی5-FU کاهش یافته و همراه با افت سطح گونههای اکسیژن فعال[5] (ROS)، پاسخ ضدتوموری دارو تضعیف میشود (18). همچنین Lu و همکاران نشان دادند که در سلولهای مقاوم به 5-FU، مسیرهای گلیکولیتیک (GLUT1، HK2، LDH-A) فعالتر میشوند و مهار این مسیرها حساسیت سلولها به دارو را بازمیگرداند (19).
از سوی دیگر، نتایج تیمار سلولها با عسل نشان داد که هر دو نوع عسل High-PAD score و Low-PAD score در غلظتهای 625/0 تا 10 درصد باعث کاهش معنادار زندهمانی سلولها شدند، اما این اثر در عسل High-PAD score بارزتر بود. این یافته با گزارشAfrin و همکاران همخوانی دارد که نشان دادند عسل مانوکا در ترکیب با5-FU موجب افزایش ROS، القای آپوپتوز و تغییر فنوتیپهای متابولیک میشود (20). Cianciosi و همکاران نیز بیان کردند که ترکیبات فنولی عسل میتوانند اثرات ضدتوموری داشته و در ترکیب با داروهای شیمیدرمانی بهطور سینرژیک عمل کنند (21). همچنین Waheed و همکاران نشان دادند که فلاونوئیدهایی مانند کوئرستین از طریق نفوذپذیری غشای خارجی میتوکندری(MOMP) مسیر آپوپتوز را در سلولهای HT-29 فعال میکنند (22). بنابراین میتوان گفت که کیفیت بیوشیمیایی عسل (ظرفیت فنولی و آنتیاکسیدانی) در تعیین شدت اثر ضدتوموری نقش اساسی دارد.
نتایج ما نشان داد که عسل Low-PAD score در غلظت پایین (%625/) تأثیری بر حساسیت سلولها به5-FU نداشت، در حالی که ترکیب5-FU با همان غلظت از عسل High-PAD score کاهش چشمگیر زندهمانی سلولها را رقم زد (0001/0>P). این اثر همافزایی با یافتههای Afrin و همکاران و Cianciosi و همکاران همسو است که نقش ترکیبات فنولی غنی را در تقویت پاسخ به5-FU تأیید کردهاند (20).
بررسی شاخص LDH نرمالشده نشان داد که در اغلب گروههای تیمارشده در محیط Normal Glc تفاوت معنیدار نسبت به کنترل وجود دارد (0001/0≥P) . این یافته بیانگر فعالشدن مسیرهای مرگ سلولی و آسیب غشایی است. عدم وجود تفاوت معنادار بین گروه سلولهای تیمار شده با 5-FU در محیط High Glc و گروه کنترل High Glc را میتوان ناشی از دو عامل دانست: کاهش تعداد سلولهای زنده و شرایط تنشزای متابولیکی که باعث تغییر در آزادسازی LDH میشود. مشابه این پدیده، Chan و همکاران تأکید کردهاند که سنجش LDH بهتنهایی نمیتواند تمایز دقیق آپوپتوز از نکروز را مشخص کند و باید همراه با آزمونهای مکمل مانند Annexin V/PI و فعالیت کاسپازها تفسیر شود (22). همچنین Fotakis وTimbrell نیز بر محدودیتهای LDH در شرایطی که تعداد سلولها کاهش مییابد تأکید کردند (23).
یافتههای ما نشان داد که مصرف گلوکز در گروه ترکیبی (5-FU + High-PAD score) بهطور معناداری بیشتر از گروه عسلHigh-PAD score بهتنهایی بود (05/0≥P). این موضوع میتواند نشاندهنده پاسخ متابولیکی تطابقی سلولها تحت درمان با 5-FU باشد. مطالعات نشان دادهاند که بازآرایی مسیرهای گلیکولیتیک در مقاومت به5-FU نقش مهمی دارد (24).Xiang و همکاران گزارش کردند که فعالسازی STAT3/HK2 باعث تقویت گلیکولیز و مقاومت به5-FU در سلولهای کولورکتال میشود (25). از سوی دیگر، Denise و همکاران نشان دادند که سلولهای مقاوم به5-FU بیشتر به OXPHOS وابسته میشوند و مصرف گلوکز در آنها کاهش مییابد (26). بنابراین افزایش مصرف گلوکز در گروه ترکیبی ما میتواند یک پاسخ حاد و گذرا به استرس ناشی از داروی 5-FU و استرس اکسیداتیو ناشی از حضور فنولهای عسل باشد، پیش از آنکه سلولها به سمت فاز پایدارتر مقاومت و وابستگی بهOXPHOS تغییر کنند.
نتیجهگیری
نتایج این مطالعه نشان داد که وجود گلوکز بالا مقاومت سلولهای HT-29 به داروی 5-FU را افزایش میدهد. عسل مورد استفاده در این مطالعه (عسل آپیزان، شرکت کاووش آریان آزما)، به ویژه عسل با PAD score بالا، توانست بهتنهایی اثرات ضدتوموری داشته و در ترکیب با 5-FU اثر همافزایی معنیداری ایجاد کند. همچنین شاخص LDH و الگوی مصرف گلوکز نشان دادند که تغییرات متابولیکی نقش مهمی در پاسخ سلولی به دارو دارند. این یافتهها پیشنهاد میکنند که ترکیب عوامل طبیعی با داروهای شیمیدرمانی میتواند رویکردی نویدبخش برای بهبود درمان سرطان کولورکتال باشد.
محدودیتهای مطالعه
از محدودیتهای این مطالعه، عدم گنجاندن گروه+ 5-FU عسل (PAD score بالا و پایین) در محیط High Glc و فقدان کنترلهای هماسمولار است؛ زیرا افزودن عسل در محیط با غلظت گلوکز بالا (High Glc) میتواند با افزایش بار قندی و تغییر اسمولاریته، بههمراه ویژگیهای ذاتی عسل(glucose oxidase، pH پایین)، متغیرهای مداخلهگر ایجاد کرده و تفسیر اختصاصی اثر PAD score را دشوار سازد. همچنین، اسمولاریته و گلوکز خارجسلولی بهطور پویشی پایش نشد و جزء پلیفنولیِ کمقند به صورت جداگانه آزمون نشد. این ملاحظات قابلیت تعمیم یافتهها را محدود میکند و ضرورتِ مطالعات تکمیلی با کنترلهای هماسمولار، سنجشهای بیوانرژتیک (میزان مصرف ATP) و بهکارگیری جزء پلیفنولیِ کمقند را برجسته میسازد. همچنین از محدودیتهای دیگر می توان به بررسی و استفاده از تنها یک رده سلولی سرطان کولورکتال، عدم بررسی مکانیزمهای دقیق مولکولی، عدم بررسی اثرات عسل و 5-FU در شرایط in vivo و عدم استفاده از روشهای چندگانه برای تعیین زندهمانی مثل آپوپتوز یا نکروز اشاره کرد. همچنین اثر قندهای منفرد عسل (گلوکز، فروکتوز، ساکاروز) بهطور جداگانه و با کنترلهای هماسمولار ارزیابی نشد؛ بنابراین یافتهها بازتابدهندهی اثر کل عسل است.
تقدیر و تشکّر
این مقاله حاصل طرح پژوهشی مصوب با کد 6663 میباشد. نویسندگان، مراتب تقدیر و تشکر خود را از حوزه معاونت تحقیقات و فناوری و آزمایشگاه جامع تحقیقات دانشگاه علوم پزشکی بیرجند اعلام میدارند.
ملاحظات اخلاقی
مطالعه حاضر پس از تأیید شورای پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی بیرجند و اخذ مجوز اخلاق با کد IR.BUMS.REC.1403.342 انجام شد.
حمایت مالی
این مطالعه با حمایت مالی دانشگاه علوم پزشکی بیرجند اجرا شده است.
مشارکت نویسندگان
مفهومسازی و طراحی مطالعه: الهام چمنی، محسن خراشادیزاده، اصغر زربان.
انجام آزمایشات: ارشیا مصباح موسوی.
تأمین منابع: الهام چمنی.
اعتبارسنجی دادهها: محسن خراشادیزاده و الهام چمنی.
نگارش – پیشنویس اولیه: ارشیا مصباح موسوی، الهام چمنی.
نگارش – بازنگری و ویرایش: الهام چمنی، محسن خراشادیزاده.
تأیید نهایی نسخهی آماده انتشار: اصغر زربان، محسن خراشادیزاده، الهام چمنی.
پاسخگویی در قبال صحت و تمامیت کار: ارشیا مصباح موسوی، الهام چمنی.
تضاد منافع
نویسندگان مقاله اعلام میدارند که هیچ گونه تضاد منافعی در پژوهش حاضر وجود ندارد.
1 Colorectal cancer
[2] Warburg effect
[3] Lactate dehydrogenase A
[4] Phenolic level, Antioxidant level, Diastase activity
[5] Reactive oxygen species
نوع مطالعه: مقاله اصیل پژوهشی |
موضوع مقاله:
بیوشیمی- سرطان و ژنتیک
دریافت: 1404/6/21 | پذیرش: 1404/8/8 | انتشار الکترونیک پیش از انتشار نهایی: 1404/10/3 | انتشار الکترونیک: 1404/8/20
دریافت: 1404/6/21 | پذیرش: 1404/8/8 | انتشار الکترونیک پیش از انتشار نهایی: 1404/10/3 | انتشار الکترونیک: 1404/8/20
فهرست منابع
1. Bray F, Laversanne M, Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Soerjomataram I, et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2024;74(3):229-63. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38572751/ [DOI:10.3322/caac.21834] [PMID]
2. Van der Jeught K, Xu H-C, Li Y-J, Lu X-B, Ji G. Drug resistance and new therapies in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 2018;24(34):3834. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30228778/ [DOI:10.3748/wjg.v24.i34.3834] [PMID] []
3. Longley DB, Harkin DP, Johnston PG. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 2003;3(5):330-8. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12724731/ [DOI:10.1038/nrc1074] [PMID]
4. Zhang N, Yin Y, Xu S-J, Chen W-S. 5-Fluorouracil: mechanisms of resistance and reversal strategies. Molecules. 2008;13(8):1551-69. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18794772/ [DOI:10.3390/molecules13081551] [PMID] []
5. Zhao H, Wu K. Effect of hyperglycemia on the occurrence and prognosis of colorectal cancer. Am J Transl Res. 2024;16(5):2070. URL: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC11170586/ [DOI:10.62347/NYHH3132] [PMID] []
6. Wang M, Zhou Q, Cao T, Li F, Li X, Zhang M, et al. Lactate dehydrogenase A: a potential new target for tumor drug resistance intervention. J Transl Med. 2025; 23(1): 713.
https://doi.org/10.1186/s12967-025-06773-z [DOI:10.1186/s12967-023-04547-z] [PMID] []
7. Zhang Q, Luo Y, Qian B, Cao X, Xu C, Guo K, et al. A systematic pan-cancer analysis identifies LDHA as a novel predictor for immunological, prognostic, and immunotherapy resistance. Aging (Albany NY). 2024;16(9):8000-18. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38709280/ [DOI:10.18632/aging.205800]
8. Zhang K, Zhang T, Yang Y, Tu W, Huang H, Wang Y, et al. N6-methyladenosine-mediated LDHA induction potentiates chemoresistance of colorectal cancer cells through metabolic reprogramming. Theranostics. 2022;12(10):4802-17. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35832094/ [DOI:10.7150/thno.73746] [PMID] []
9. Wu J, Chen J, Xi Y, Wang F, Sha H, Luo L, et al. High glucose induces epithelial-mesenchymal transition and results in the migration and invasion of colorectal cancer cells. Exp Ther Med. 2018;16(1):222-30. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29896243/ [DOI:10.3892/etm.2018.6189]
10. Li W, Zhang X, Sang H, Zhou Y, Shang C, Wang Y, et al. Effects of hyperglycemia on the progression of tumor diseases. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):327. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31337431/ [DOI:10.1186/s13046-019-1309-6] [PMID] []
11. Al Refaey HR, Newairy A-SA, Wahby MM, Albanese C, Elkewedi M, Choudhry MU, et al. Manuka honey enhanced sensitivity of HepG2, hepatocellular carcinoma cells, for Doxorubicin and induced apoptosis through inhibition of Wnt/β-catenin and ERK1/2. Biol Res. 2021;54(1):16. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34049576/ [DOI:10.1186/s40659-021-00339-1] [PMID] []
12. Karbasi S, Asadian AH, Azaryan E, Naseri M, Zarban A. Quantitative analysis of biochemical characteristics and anti-cancer properties in MCF-7 breast cancer cell line: a comparative study between Ziziphus jujube honey and commercial honey. Mol Biol Rep. 2024;51(1):344. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38400882/ [DOI:10.1007/s11033-024-09219-9] [PMID]
13. Mohammadi Y, Tahergorabi Z, Sharifzadeh GR, Rajabi Moghadam M, Zarban A. Protective Effects of Some Graded Iranian Honey Samples Against Cold Water Immersion‐Induced Gastric Ulcers in Rats.Food Sci Nutr. 2024;12(12):10211-22. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39723096/ [DOI:10.1002/fsn3.4567] [PMID] []
14. Blake DA, McLean NV. A colorimetric assay for the measurement of D-glucose consumption by cultured cells. Anal Biochem. 1989;177(1):156-60. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2742145/ [DOI:10.1016/0003-2697(89)90031-6] [PMID]
15. Hulme C, Westwood M, Myers J, Heazell A. A high-throughput colorimetric-assay for monitoring glucose consumption by cultured trophoblast cells and placental tissue. Placenta. 2012;33(11): 949-51. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22951137/ [DOI:10.1016/j.placenta.2012.08.001] [PMID]
16. TeSlaa T, Teitell MA. Techniques to monitor glycolysis. Methods Enzymol. 2014; 542: 91-114. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24862262/ [DOI:10.1016/B978-0-12-416618-9.00005-4] [PMID] []
17. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-49. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33538338/ [DOI:10.3322/caac.21660] [PMID]
18. Bergandi L, Mungo E, Morone R, Bosco O, Rolando B, Doublier S. Hyperglycemia promotes chemoresistance through the reduction of the mitochondrial DNA damage, the Bax/Bcl-2 and Bax/Bcl-XL ratio, and the cells in Sub-G1 phase due to antitumoral drugs induced-cytotoxicity in human colon adenocarcinoma cells.Front Pharmacol. 2018;9:866. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30150934/ [DOI:10.3389/fphar.2018.00866] [PMID] []
19. Lu Y-n. Blocking lncRNA NOP14-AS1 overcomes 5-Fu resistance of colon cancer cells by modulating miR-30a-5p-LDHA-glucose metabolism pathway. Discov Oncol. 2025;16(1):1-12. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40180667/ [DOI:10.1007/s12672-025-02156-4] [PMID] []
20. Afrin S, Giampieri F, Forbes-Hernández TY, Gasparrini M, Amici A, Cianciosi D, et al. Manuka honey synergistically enhances the chemopreventive effect of 5-fluorouracil on human colon cancer cells by inducing oxidative stress and apoptosis, altering metabolic phenotypes and suppressing metastasis ability. Free Radic Biol Med. 2018;126:41-54. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30056083/ [DOI:10.1016/j.freeradbiomed.2018.07.014] [PMID]
21. Cianciosi D, Forbes-Hernández TY, Afrin S, Gasparrini M, Reboredo-Rodriguez P, Manna PP, et al. Phenolic compounds in honey and their associated health benefits: A review. Molecules. 2018;23(9):2322. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30208664/ [DOI:10.3390/molecules23092322] [PMID] []
22. Waheed M, Hussain MB, Javed A, Mushtaq Z, Hassan S, Shariati MA, et al. Honey and cancer: A mechanistic review. Clin Nutr. 2019;38(6):2499-503. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30639116/ [DOI:10.1016/j.clnu.2018.12.019] [PMID]
23. Chan FK-M, Moriwaki K, De Rosa MJ. Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity. Immune Homeostasis: Methods Mol Biol. 2013:979: 65-70. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23397389/ [DOI:10.1007/978-1-62703-290-2_7] [PMID] []
24. Fotakis G, Timbrell JA. In vitro cytotoxicity assays: comparison of LDH, neutral red, MTT and protein assay in hepatoma cell lines following exposure to cadmium chloride. Toxicol Lett. 2006;160(2):171-7. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16111842/ [DOI:10.1016/j.toxlet.2005.07.001] [PMID]
25. Xiang J, Zhang H, Shen K, Feng J, Yang K, Shi T, et al. SPARC Promotes Aerobic Glycolysis and 5‐Fluorouracil Resistance in Colorectal Cancer Through the STAT3/HK2 Axis. Cancer Med. 2025;14(11):e70972. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40415238/ [DOI:10.1002/cam4.70972] [PMID] []
26. Denise C, Paoli P, Calvani M, Taddei ML, Giannoni E, Kopetz S, et al. 5-fluorouracil resistant colon cancer cells are addicted to OXPHOS to survive and enhance stem-like traits. Oncotarget. 2015;6(39):41706. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26527315/ [DOI:10.18632/oncotarget.5991] [PMID] []
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
Attribution-NoneCommercial CC BY-NC