تحقیقات پزشکی ترجمانی

مقدمه
مطالعات اپیدمیولوژیک نشان می‌دهد که میانگین شیوع ناباروری در جهان 10 درصد است. کمترین و بیشترین شیوع ناباروری به ترتیب در استرالیا و آفریقا گزارش شده است. شیوع ناباروری در ایالات متحده، 10 تا 15 درصد، در چین حدود 9 درصد و در ایران 2/13 درصد است. مطالعات نشان می‌دهد که یک ششم زوج‌ها از ناباروری رنج می‌برند و عوامل محیطی، شغلی و به‌ویژه ژنتیکی را در بروز آن دخیل می دانند (1).
یکی از عوامل مهم مرتبط با ناباروری مردان، کمیّت و کیفیت اسپرم تولید شده است (2). شکست اسپرماتوژنز ناشی از عوامل متعددی از جمله بیماری‌های سیستمیک، اختلالات غدد درون‌ریز، سوءتغذیه، عوامل ژنتیکی و خطرات محیطی است (3). همان‌طور که مطالعات اپیدمیولوژیک و مطالعات تجربی روی  حیوانات آزمایشگاهی نشان داده است که، فلزات سنگین ممکن است تولید‌مثل جنس نر را به خطر بیندازند (4). مسمومیت با سرب باعث مهار عملکرد بیضه‌ها به همراه عملکرد غدد جنسی ثانویه مانند پروستات، اپیدیدیم و وزیکول سمینال می‌شود و در نتیجه ترکیب بیوشیمیایی آن‌ها تغییر می‌کند و هم بر اسپرماتوژنزیس و گامتوژنز تأثیر دارد (5). تجمع سرب در بیضه دارای اثر ضد‌اسپرم‌زایی است (6). مواجهه با سرب موجب آسیب اکسیداتیو می‌شود که یکی از مکانیسم‌های احتمالی مسمومیت با سرب است که نشان می‌دهد آنتی‌اکسیدان‌ها ممکن است در درمان مسمومیت با سرب نقش داشته باشند (7).
گیاهان دارویی حاوی فنل و فلاونوئیدها به دلیل نقش آنتی‌اکسیدانی خود، به‌طور مستقیم با وارد شدن در واکنش‌های احیایی، مانع تنش اکسیداتیو می‌شوند و مانند بسیاری دیگر از پلی‌فنل‌ها، جمع‌کننده رادیکال‌های آزاد هستند زیرا به‌عنوان گروه‌های قوی الکترون دهنده و پروتون دهنده عمل می‌کنند (8). تخم کتان با نام علمی Linum Usitatissimum L. از گیاهان دارویی مهم است و از جمله خواص تخم کتان خاصیت آنتی‌اکسیدانی بالای آن است. تخم کتان مقادیر زیادی لیگنان دارد (9، 10). لیگنان‌ها نوعی فیبر پلی‌فنلی و یکی از گروه‌های اصلی فیتواستروژن‌ها هستند و در مواد غذایی مانند میوه‌ها، سبزیجات و دانه‌های روغنی به‌ویژه دانه کتان یافت می‌شود. لیگنان‌ها گروهی از ترکیبات طبیعی فنلی هستند که اسکلت کربنی آن‌ها بر اساس اتصال واحدهای C3C6 بنا شده است و دارای اثرات آنتی‌اکسیدانی، ضد‌میکروبی، ضد‌ویروسی و ضدسرطانی هستند (11). اسید اسکوربیک یا ویتامین C این ویتامین محلول در آب است و دارای چندین اثر غیر آنزیمی به واسطه فعالیت خود به‌عنوان یک عامل احیاء کننده و از بین برنده رادیکال‌های آزاد اکسیژن است. در ضمن موجب احیاء ویتامین E اکسید شده توسط مواد اکسید کننده نیز می‌گردد. اسید آسکوربیک در اکسیداسیون و احیاء طی تنفس سلولی و فرآیندهای متابولیکی مختلف و مقاومت در برابر عفونت و برای پیشرفت روند تکوین سلول‌های جنسی لازم و ضروری است (12)، اسید اسکوربیک در ممانعت از آثار تخریبی استرس اکسیداتیو بر سلول نقش دارد (13،14). تحقیق حاضر که به منظور ارزیابی بررسی تأثیر عصاره هیدروالکلی تخم کتان (برزک) بر تغییرات هیستوپاتولوژیک بیضه و شاخص‌های باروری اسپرم موش‌های صحرایی نر در معرض سرب بـه روش تجربی انجام شد، در راستای سلسله تلاش‌هایی است که در جهت یافتن روش‌های درمـانی گیاهی در داخل کشور صورت می‌گیرد.

روش تحقیق
نوع مطالعه و نمونه‌گیری
30 سر موش‌ صحرایی نر آلبینو نژاد ویستار با دامنه سنی 12 تا 15 هفته و وزن تقریبی 20 ± 200 گرم از انستیتو پاستور تهران تهیه و در مرکز تحقیقات آسیب‌شناسی بیمارستان دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد در شرایط آزمایشگاهی 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی و دمای 2 ± 24 سانتی‌گراد با دسترسی آزاد به آب و غذای استاندارد و بر اساس دستورالعمل‌های کمیته حمایت از حیوانات آزمایشگاهی با کد اخلاق IR.IAU.SHK.REC.1402.046 نگهداری شدند.
موش‌های صحرایی پس از یک هفته در شرایط آزمایشگاهی و تطابق با این شرایط در 5 گروه 6 تایی به شرح ذیل تقسیم شدند.
گروه کنترل: دریافت کننده آب مقطر (10 میلی‌لیتر بر کیلوگرم) به‌صورت خوراکی به‌مدت 35 روز
گروه دوم: گروه تحت درمان با استات سرب )50 میلی‌گرم بر کیلوگرم) به‌صورت خوراکی به‌مدت 35 روز
گروه سوم: گروه تحت درمان با استات سرب (50 میلی‌گرم بر کیلوگرم) به‌صورت خوراکی و سه ساعت بعد عصاره هیدروالکلی برزک (300 میلی‌گرم بر کیلوگرم) به‌مدت 35 روز.
گروه چهارم: گروه تحت درمان با استات سرب (‌50 میلی‌گرم بر کیلوگرم) به‌صورت خوراکی و سه ساعت بعد اسید آسکوربیک (300 میلی‌گرم بر کیلوگرم) به‌مدت 35 روز.
گروه پنجم: گروه تحت درمان با استات سرب )50 میلی‌گرم بر کیلوگرم) به‌صورت خوراکی و سه ساعت بعد اسید آسکوربیک (300 میلی‌گرم بر کیلوگرم) و عصاره هیدروالکلی برزک (300 میلی‌گرم بر کیلوگرم) به‌مدت 35 روز (3).
موش‌های صحرایی نر بعد از 12 ساعت از پایان تزریق و گاواژ دارو از دسترسی به غذا دور نگهداشته شدند و توسط ترازوی دیجیتال بویکو مدلBWL 51  ساخت کشور آلمان با دقت 01/0 گرم توزین شدند. در پایان دوره مطالعه موش‌های صحرایی با اتر بی‌هوش، به روش معمول محوطه شکمی باز، بافت بیضه به همراه اپیدیدیم سمت راست خارج و اسپرم به محیط اختصاصی کشت هام جهت بررسی مورفولوژیک و شمارش اسپرم‌های زنده انتقال یافت. سپس خون‌گیری از قلب (cardiacpuncture) تحت بی‌هوشی به منظور انجام آزمایش‌‌ها‌ی اندازه‌گیری مالون دی آلدئید و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی سرم، بعد از خون‌گیری به‌وسیله سرنگ بدون ماده ضد‌انعقاد، نمونه خونی اخذ شده به وسیله دستگاه سانتریفیوژ هیتیچ مدل EBA 200 ساخت کشور آلمان به مدت 10 دقیقه در 3000 دور سانتریفیوژ گردید و سرم به‌دست آمده از نمونه خون جدا شد و تا زمان انجام آزمایش‌های سرمی در دمای 70- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

تهیه گیاه و عصاره‌گیری
در این مطالعه آزمایشگاهی، بذر گیاه کتان پس از خرید از مراکز تولید بذر توسط کارشناس مرکز تحقیقات گیاهان دارویی دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد تأیید و به شماره هرباریوم 1051 ثبت گردید. سپس تخم گیاه کتان پودر شده و از الک عبور داده‌ شد و در ظرف شیشه‌ای و در جای خنک به‌منظور عصاره‌گیری و انجام آزمایش‌های مربوطه مورد استفاده قرار گرفت. عصاره بذر کتان به روش ماسیراسیون با استفاده از حلال اتانول در دو نوبت تهیه شد. ابتدا 500 گرم از پودر بذر گیاه الک شده با ترازوی دیجیتال توزین شد. پودر توزین شده را درون بشر ریخته و اتانول 80 درصد به آن اضافه شد تا سطح پودر را به‌طور کامل بپوشاند. مخلوط حاصل به مدت 40 ساعت بر روی شیکر با شدت 100 دور در دقیقه در شرایط تاریکی و دمای اتاق قرار داده شد. مخلوط اتانولی با استفاده از قیف بوخنر و کاغذ واتمن شماره 42 صاف شده و به منظور حذف حلال و تغلیظ عصاره اتانولی از دستگاه تقطیر در خلاء چرخان با دمای 50 درجه سانتی‌گراد استفاده شد. عصاره به‌دست آمده در داخل آون قرار گرفت تا به‌طور کامل خشک گردد. عصاره خشک شده، توزین و در پلیت شیشه‌ای سربسته ریخته و با فویل آلومینیوم پوشانده شد و تا زمان انجام مراحل بعدی تحت شرایط مناسب نگهداری گردید.

مراحل انجام کار برای شمارش اسپرم
1- قرار دادن میکروتیوب 5/1 میلی‌لیتری حاوی 500 میکرولیتر محیط کشت Human Tubal Fluid (HTF) در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد
2- جدا کردن ناحیه دم اپیدیدیم از بیضه و قرار‌دادن آن در میکرو تیوب حاوی HTF گرم و برش زدن آن با قیچی به‌منظور آزاد شدن اسپرم از آن، افزودن 500 میکرولیتر HTF به میکرو تیوب و سپس انکوبه کردن آن به مدت 10 دقیقه
3- مخلوط کردن نمونه و سپس برداشت 5 میکرولیتر از آن به 500 میکرولیتر آب مقطر به منظور شمارش اسپرم
4- قراردادن 5 میکرولیتر از نمونه بر روی لام مخصوص آنالیز اسپرم به منظور بررسی تحرک اسپرم
5- بررسی تحرک اسپرم
6- قراردادن 15 میکرولیتر از رنگ ائوزین نیگروزین بر روی لام، افزودن 15 میکرولیتر نمونه اسپرم به آن، مخلوط کردن رنگ و نمونه اسپرم، تهیه اسمیر 30 ثانیه پس از افزودن نمونه اسپرم، سپس خشک شدن نمونه و بررسی مورفولوژی و تعیین درصد اسپرم‌های زنده و مرده در زیر میکروسکوپ با لنزهای 40 و 100 (بزرگنمایی 400 و 1000 برابر)
7- شمارش اسپرم با استفاده از لام نئوبار

آماده نمودن بافت‌ بیضه برای مطالعات میکروسکوپ
بافت بیضه سمت چپ در داخل فرمالین بافر 10 درصد انتقال و پس از مراحل آب‌گیری، شفاف‌سازی و آغشتگی با پارافین، برش‌های به ضخامت 5 میکرون از بلوک‌‌های پارافینی تهیه و به روش هماتوکسیلین و ائوزین رنگ آمیزی شد.

اندازه‌گیری غلظت مالون دی آلدئید و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی سرم
میزان مالون دی آلدئید (MDA) سرم با استفاده از روش کالریمتری واکنش اسید تیوباربیتوریک با مالون دی آلدئید که ایجاد ترکیب رنگی با جذب نوری در 532 نانومتر می‌کند، اندازه‌گیری شد ‌(15). ظرفیت آنتی‌اکسیدان سرم نیز با استفاده از ترکیب تری پیریدیل تری آذین TPTZ و با استفاده از اسپکتروفتومتر در طول موج 593 نانومتر تعیین شد ‌(16).

آنالیزهای آماری
نتایج به‌دست آمده به وسیله برنامه SPSS24 و با استفاده از روش آنالیز واریانس یک‌طرفه ‌(ANOVA) و آزمون مقایسه‌ای تعقیبی توکی استفاده شد و تغییرات هیستوپاتولوژیک بر اساس روش توصیفی گزارش گردید، نمودارها با استفاده از نرم‌افزار گراف پد پریزم ترسیم شد.

یافته‌ها
تحرک اسپرم
نتایج تحرک اسپرم بین گروه کنترل با سایر گروه‌ها‌، افزایش آماری معنادار را نشان‌داد )002/0=P). اما بین گروه تحت مواجهه با سرب با گروه‌های تحت مواجهه با سرب با برزک (67/0P=)، سرب با ویتامین C (47/0P=) و سرب با برزک و ویتامین C (37/0P=) اختلاف آماری معنادار نداشت (شکل1).

حرکت پیش‌رونده
نتایج میانگین حرکت پیش‌رونده اسپرم بین گروه کنترل با سایر گروه‌های تیمار شامل: گروه تحت مواجهه با سرب (007/0P=)، سرب و برزک (02/0P=)، سرب و ویتامین C (006/0=P) افزایش آماری معنادار را نشان داد. اما بین گروه تحت مواجهه با سرب با گروه‌های تحت مواجهه با سرب با برزک (67/0P=)، سرب با ویتامین C (47/0P=) و سرب با برزک و ویتامین C (955/0P=) اختلاف آماری معنادار مشاهده نشد (شکل 1).

درصد زنده ماندن اسپرم
نتایج درصد زنده ماندن اسپرم بین گروه‌ کنترل و سایر گروه‌های تحت مطالعه اختلاف آماری معنادار را نشان نداد (136/0=P)(شکل 1).

درصد نقص سر
نتایج درصد نقص سر اسپرم بین گروه‌‌ کنترل و سایر گروه‌های تحت مطالعه اختلاف آماری معنادار را نشان داد (01/0=P) (شکل 1).
درصد نقص سر اسپرم در گروه تحت درمان با سرب نسبت به گروه کنترل افزایش معنادار را نشان داد (05/0=P)، در گروه تحت مواجهه با سرب و تحت درمان با برزک و ویتامین C نسبت به گروه کنترل افزایش معنادار داشت (033/0=P). در گروه تحت مواجهه با سرب و تحت درمان با برزک نسبت به گروه کنترل افزایش معنادار را نشان داد )027/0=P). در گروه تحت مواجهه با سرب و تحت درمان با ویتامین C نسبت به گروه کنترل افزایش معنادار را نشان داد (008/0=P) (شکل1).

درصد نقص دم
نتایج درصد نقص دم اسپرم بین گروه‌های تحت مطالعه اختلاف آماری معنادار را نشان داد (009/0=P) (شکل1). درصد نقص دم در گروه تحت مواجهه با سرب و درمان با عصاره برزک و ویتامین C نسبت به گروه کنترل افزایش معنادار را نشان داد (016/0=P). همچنین درصد نقص دم اسپرم در گروه تحت مواجهه با سرب و درمان با برزک نسبت به گروه کنترل افزایش معنادار را نشان داد (016/0=P). درصد نقص دم اسپرم در گروه تحت مواجهه با سرب و درمان با ویتامین C در مقایسه با گروه کنترل افزایش معنادار را نشان داد )023/0=P) (شکل 1).

شمارش اسپرم
نتایج شمارش اسپرم بین گروه‌ کنترل و سایر گروه های تحت مطالعه اختلاف آماری معنادار را نشان نداد (818/0=P) (شکل 2).

یافته‌های آزمون استرس اکسیداتیو
میزان MDA سرم موش‌های صحرایی گروه کنترل نسبت به سایر گروه‌ها کاهش معنادار داشت (01/0>P). مقدار ظرفیت آنتی‌اکسیدانی پلاسما (FRAP) در سرم گروه کنترل نسبت به سایر گروه‌های تحت مطالعه افزایش معنادار را نشان داد (01/0>P)(شکل 3).

شکل 1- درصد کلی اسپرم‌های متحرک، حرکت فعال و مستقیم اسپرم، درصد اسپرم‌های زنده، درصد اسپرم با مورفولوژی سر غیر‌طبیعی و درصد اسپرم با مورفولوژی غیر‌طبیعی دم در موش صحرایی نر تحت مواجهه با سرب، ویتامین C و عصاره هیدروالکلی برزک‌. (حروف غیر‌مشابه a , b در بالای هر ستون نشان دهنده اختلاف معنادار (01/0>P).



شکل 2- تعداد اسپرم (میلیون/میلی‌لیتر) در موش‌های صحرایی نر تحت مواجهه با سرب، ویتامین C و عصاره هیدروالکلی برزک‌. (حروف مشابهa  در بالای هر ستون نشان دهنده عدم اختلاف معنادار(01/0<P).

شکل 3- سطح مالون دی آلدئید و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی در موش‌های صحرایی نر تحت مواجهه با سرب، ویتامین C و عصاره هیدروالکلی برزک‌. (حروف غیرمشابهa  و b در بالای هر ستون نشان دهنده اختلاف معناداراست (01/0>P).

نتایج هیستوپاتولوژی بیضه
ارزیابی هیستوپاتولوژی بیضه موش‌های صحرایی گروه کنترل
در گروه کنترل ساختار بافت‌شناسی بیضه و لوله‌های اسپرماتوژنز به‌صورت طبیعی مشاهده گردید؛ همچنین بین لوله‌های اسپرم‌ساز سلول‌‌های لایدیگ با ساختار طبیعی مشاهده شد. به صورتی که سلول‌های اسپرماتوگونی به صورت هسته پررنگ و هیپرکروماتین و سیتوپلاسم اندک بر روی غشاء پایه قرار گرفته و در بین سلول‌های اسپرماتوگونی سلول سرتولی واقع شده و بر روی سلول‌های اسپرماتوگونی سلول‌های اسپرماتوسیت اولیه که بزرگترین سلول‌های منی‌ساز بود با کروماتین مشخص و هاله‌ای از سیتوپلاسم صورتی رنگ مشاهده گردید، همچنین به سمت مرکز اسپرماتوسیت اولیه و اسپرماتوزوئید به صورت طبیعی رؤیت شد و در قسمت مرکز اسپرماتوزوا مشاهد شد (شکل A).

ارزیابی هیستوپاتولوژی بیضه موش‌های صحرایی تحت مواجه با استات سرب
در بافت بیضه موش‌های صحرایی تحت مواجهه با استات سرب در لومن لوله‌های اسپرم‌ساز کاهش بلوغ و فقدان اسپرماتوزا مشاهده شد. همچنین سلول‌های اسپرماتوسیت اولیه و اسپرماتیدها دچار نکروز و تغییرات دژنراتیو شده بودند. همچنین در بین لوله‌های اسپرم‌ساز سلول‌های بنیادی (سلول‌های لایدیگ) کاهش را نشان دادند (شکل B، C) آتروفی و دژنراسیون سلول‌های اسپرم‌ساز مشاهده‌ گردید. در برخی نواحی کاهش شدید سلول‌های اسپرماتوگونی مشاهده شد؛ همچنین سلول‌های ژنوم از بخش غشاء پایه جدا شده و به داخل لومن ریخته و در بخشی از توبول، از بین رفتن کامل غشاء سلولی مشاهده گردید.
فشرده شدن هسته‌ها همراه با سیتوپلاسم ائوزونوفیلی و کاهش تراکم سلول‌های اپی‌تلیوم اسپرم‌ساز در بافت بیضه موش‌های تحت مواجهه با سرب مشاهده شد (شکلC ). موش‌های صحرایی تحت مواجهه با سرب و ویتامین C واکوئل‌های روشن پراکنده در بین سلول‌های اسپرماتوگونی لوله‌های اسپرم ساز مشاهده شد؛ اما ساختار لوله‌های اسپرم‌ساز تا حدودی طبیعی بود، همچنین در بیشتر توبول‌ها سلول‌های اسپرماتوزا دچار تغییرات، دژنراسیون و نکروز شده بود و کاهش تعداد اسپرماتیدها مشاهده گردید (شکلE, F).

تصویر یک- تصویر میکروسکوپی بافت بیضه موش صحرایی، لوله‌های اسپرم ساز. گروه کنترل. شکل A -بافت بیضه، لوله‌های اسپرم ساز موش صحرایی گروه کنترل. لوله‌های اسپرم ساز (S.F)، اپی‌تلیوم لوله‌های اسپرم‌ساز، لومن لوله‌های اسپرم ساز (L.S.T) و سلول‌های بین لوله‌های اسپرم ساز (سلول‌های لایدیگ: L.C). (رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین ×100). B- بافت بیضه، لوله‌های اسپرم ساز موش صحرایی گروه تحت مواجهه با استات سرب (50 میلی‌گرم بر کیلو‌گرم)‌، پیکان قرمز روند نکروز اپی‌تلیوم اسپرم‌ساز، دژنراسیون واکوئلار (رنگ آمیزی هماتوکسیلین×.). C. بافت بیضه، لوله‌های اسپرم‌ساز موش صحرایی گروه تحت مواجهه با استات سرب (50 میلی گرم بر کیلو گرم) و تحت درمان با برزک (300 میلی‌گرم بر کیلوگرم) ، تغییرات دژنراتیو و نکروز در اپی‌تلیوم لوله‌های اسپرم‌ساز (سرپیکان قرمز) و واکوئل‌های متعدد در میان لوله‌های اسپرم‌ساز (پیکان قرمز) (رنگ آمیزی هماتوکسیلین×ائوزین).D . بافت بیضه، لوله‌های اسپرم‌ساز موش صحرایی تحت مواجهه با استات سرب با دوز 50 میلی‌گرم بر کیلوگرم و تحت درمان با اسید اسکوربیک با دوز 300 میلی گرم بر کیلوگرم. تغییرات نکروز اسپرماتوسیت اولیه و سلول‌های اسپرماتید (پیکان سفید). (رنگ آمیزی هماتوکسیلین× 100). E. بافت بیضه، لوله‌های اسپرم ساز موش صحرایی گروه تحت مواجهه با استات سرب (50 میلی گرم بر کیلوگرم) و تحت درمان با برزک و ویتامین C (300 میلی‌گرم بر کیلوگرم)‌، تغییرات دژنراتیو و نکروز سلول‌های اسپرماتید (پیکان زرد). (رنگ آمیزی هماتوکسیلین× 100).

ارزیابی هیستوپاتولوژی بیضه موش‌های صحرایی تحت مواجهه با برزک + سرب
تغییرات هیستو‌پاتولوژیک بافت بیضه در گروه تحت مواجهه با استات سرب و تحت درمان با برزک نشان داد، اگر‌چه ساختار توبول‌های اسپرم‌ساز طبیعی است اما کاهش سلول‌های اسپرماتید و اسپرماتوزا چشمگیر است. همچنین سلول‌های اسپرماتوسیت اولیه و اسپرماتید در اکثر توبول‌ها دچار تغییرات نکروز و دژنراسیون شده بودند و واکوئل‌های پراکنده در میان توبول‌های اسپرم‌ساز بین سلول‌های اسپرماتوگونی و اسپرماتید اولیه مشاهده شد. همچنین آتروفی و کاهش تعداد سلول‌ها لایدیگ (سلول‌ها بین لوله‌های اسپرم‌ساز) مشاهده گردید (شکل D).

ارزیابی هیستوپاتولوژی بافت بیضه موش‌های صحرایی تحت مواجهه با برزک + ویتامین C + سرب
در بافت بیضه موش‌های صحرایی تحت مواجهه با استات سرب، برزک و ویتامین C، کاهش تراکم سلول‌های اسپرم‌ساز قابل مشاهده بود. همچنین جدا شدن سلول‌های اسپرماتوگونی از غشاء پایه، نکروز اسپرماتیدها و اسپرماتوزا را نشان داد. در برخی توبول‌ها، اسپرماتوزا مشاهده نشد. همچنین واکوئل‌های پراکنده در میان اپی‌تلیوم سلول‌های اسپرم‌ساز مشاهده شد (شکل G). مقدار کمی سلول‌های لایدیگ در بین توبول‌های اسپرم‌ساز محیطی مشاهده و سلول‌های اسپرماتید که از نظر اندازه از اسپرماتوگونی‌ها کوچک‌تر بودند، تغییرات دژنراتیو و نکروز را نشان دادند.

بحث
در مطالعه حاضر استفاده از استات سرب با دوز 50 میلی‌گرم بر کیلوگرم به‌صورت خوراکی به‌مدت 36 روز موجب تغییرات هیستوپاتولوژی شامل روند نکروز اپی‌تلیوم اسپرم‌ساز، دژنراسیون واکوئولار (شکل B,C)، کاهش تراکم سلول‌های اپی‌تلیوم اسپرم‌ساز و اسپرماتید (شکلC) و کاهش حرکات پیش‌رونده، افزایش درصد نواقص سر و دم در مقایسه با گروه کنترل شد. نتایج ارزیابی مطالعات بافت بیضه تحت تأثیر استات سرب در مطالعه حاضر، همسو با تحقیقات و مطالعات اخیر که به‌منظور بررسی اثرات سرب بر روی پارامترهای اسپرم و تغییرات هیستوپاتولوژی بیضه انجام شد (3، 5). مطالعات بسیاری نشان داده‌ است که مسمومیت باروری از ویژگی‌های بارز مسمومیت با استات سرب محسوب می‌شود. به‌طوری‌که مسمومیت با سرب موجب تخریب اسپرماتوژنز و آپوپتــوز اپی‌تلیــوم زایای بیضه می‌شــود (19-17).  Wurlinaو همکاران نشان دادند که اثرات شدید سرب بر روی عملکرد سیستم تناسلی نر از طریق تغییرات در اسپرماتوژنز و عملکرد اسپرم ایجاد می‌شود (20).
نتایج مطالعه تجربی Wurlina و همکاران نشان داد که مواجهه موش های صحرایی نر با استات سرب با دوز 50 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن به مدت 20 روز متوالی در گروه کنترل مثبت منجر به کاهش معنی‌دار در سطح سوپراکسید دیسموتاز، یکپارچگی غشای پلاسما، کاهش تعداد سلول‌های لیدیگ و سرتولی، تعداد اسپرم، تحرک اسپرم و اسپرم‌های زنده و همچنین افزایش معنی‌دار (05/0>P) در سطح مالون دی آلدئید و اسپرم‌های آپوپتوز و نکروزه در مقایسه با گروه کنترل منفی می‌شود، اما مصرف مورینگا اولیفیرا (گز روغنی) با دوز 500 میلی گرم بر کیلوگرم به موش‌های در معرض استات سرب تغییری در تعداد اسپرم، زنده‌مانی، آپوپتوز و نکروز در مقایسه با گروه کنترل منفی نداشت (20). در مطالعه حاضر استفاده از استات سرب با گاواژ اگرچه موجب افزایش نواقص سر و دم و کاهش حرکات پیش‌رونده شد اما تأثیر معناداری بر روی تعداد اسپرم نداشت که با مطالعات Wurlina همسو نبود. دلیل معنی‌دار نبودن کاهش تعداد اسپرم در مطالعه حاضر را می‌توان چرخه اسپرماتوژنزیز 52 روزه در موش صحرایی (21)، متصور شد که مواجهه خوراکی با استات سرب به‌مدت 5 هفته متوالی تنها موجب اختلال در برخی از پارامترهای باروری اسپرم می‌شود.
استرس اکســیداتیو یکی از مهم‌ترین مکانیسم‌های مطرح شده در مورد آســیب‌های بافتی ناشی از استات سرب است (22) که با ایجاد اکسیداسیون چربی‌ها، و افزایش گونه‌های فعال اکسیژن[1] موجب تغییر در یکپارچگی و سیالیت ساختار غشاء سلولی می‌گردد (5). چندین دهه اســت که  گونه‌های فعال اکسیژن به عنوان عامل مخرب و آسیب‌رسان به سلول‌ها و بافت‌ها شناخته شده است. اسپرم نخستین سلولی است که تولید گونه‌های فعال اکسیژن در آن اثبات شــده است (23).
Abu-Khudir و همکاران نشان دادند که مواجهه خوراکی موش‌های صحرایی با استات سرب با دوز 100 میلی‌گرم بر کیلوگرم به مدت 30 روز باعث افزایش مالون دی آلدئید[2]، کاهش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی، کاهش تعداد اسپرم، کاهش حرکت، کاهش زنده ماندن اسپرم و افزایش نواقص سر و دم و تغییرات هیستوپاتولوژیک در اسپرماتوژنزیس بافت بیضه موش‌های تحت تأثیر استات سرب در مقایسه با گروه کنترل می‌شود (24). همچنین مواجهه با استات سرب به‌طور قابل توجهی باعث کاهش پارامترهای آنتی‌اکسیدانی مانند گلوتاتیون پراکسیداز[3]، کاتالاز، سوپراکسید دیسموتازو گلوتاتیون S-ترانسفراز و کاهش محتوای گلوتاتیون در سلول‌های کبدی و گلبول‌های قرمز می‌شود، علاوه بر این، استات سرب به‌طور قابل توجهی پارامترهای اکسیداتیو از جمله غلظت مالون دی آلدئید و پراکسیدهیدروژن و همچنین بیان سیکلواکسیژناز-2(COX-2)  را افزایش می‌دهد (25). حال می‌توان بر اساس مطالعات قیلی نتیجه گرفت‌، استرس اکسیداتیو (مواجهه با استات سرب) و افزایش مالون دی آلدئید یکی از دلایل اصلی ایجاد تغییرات هیستوپاتولوژیک در بافت بیضه و تغییرات در ناحیه سر و دم و کاهش حرکات پیش‌رونده است و افزایش تولید بیش از حد گونه‌های فعال اکسیژن و کاهش توانایی آنتی‌اکسیدان در مایع منی و بافت بیضه، باعث ایجاد این تغییرات می‌شود که با مطالعات حاضر مطابقت دارد. در مطالعه حاضر استفاده از اسیداسکوربیک و عصاره هیدرو‌الکلی برزک موجب افزایش حرکات پیش‌رونده و کاهش نواقص سر و دم در موش‌های تحت مواجهه با سرب در مقایسه با گروه کنترل نشد که نشان از افزایش استرس اکسیداتیو در بافت بیضه متعاقب مواجهه خوراکی با استات سرب است.
بذر کتان روغنی علاوه بر داشتن امگا-3، دارای ویتامینE نیز است. گیاه کتان حاوی مقادیر بالایی ترکیبات لیگنانی مانند پودوفیلوتوکسین در اندام‌های مختلف خود است (26). بذر کتان یکی از منابع گیاهی غنی از ان-3 اسیدهای چرب، لینولینیک اسید و منبع غنی از Secoisolariciresinol diglucoside (SDG) که پیش‌ساز لیگنان است و توسط فلور باکتریایی روده در کولون به دولیگنان انترودیول و انترولاکتون تبدیل می‌شود (27). همچنین افزایش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی روغن برزک، ممکن است با افزایش اسید آکونیتیک از طریق بیان ژن‌های ABAT و AHDHA مرتبط با مسیر متابولیسم اسید پروپیونیک، موجب بهبود کیفیت اسپرم ‌شود (28). اما در مطالعه حاضر تأثیر مفیدی بر روی شاخص‌های مورفولوژیک اسپرم و ممانعت از مسمومیت‌زایی استات سرب بر روی بافت بیضه مشاهده نشد.
ویتامین C (اسید آسکوربیک) آنتی‌اکسیدانی با وزن مولکولی پایین است که گونه‌های فعال اکسیژن مایع را از طریق انتقال خیلی سریع الکترون هضم کرده و از پراکسیداسیون چربی جلوگیری می‌کند (29). در مطالعه حاضر، استفاده از ویتامین C، عصاره هیدروالکلی و برزک، موجب افزایش حرکات پیش‌رونده و کاهش نواقص سر و دم در موش‌های تحت مواجهه با استات سرب در مقایسه با گروه کنترل مثبت نشد. به‌هرحال مصرف استات سرب با دوز 50 میلی‌گرم بر کیلوگرم و استات سرب با اسید آسکوربیک، برزک و اسید آسکوربیک همراه با عصاره هیدروالکلی برزک باعث کاهش حرکات پیش‌رونده در اسپرم، نواقص دم و نواقص سر گردید و هیچ تأثیری بر روی کاهش نواقص سر، نواقص دم و حرکت پیش‌رونده نداشت.
احمدی و همکاران در یک بررسی مبتنی بر شواهد با هدف بررسی اثرات مکمل‌های آنتی‌اکسیدانی خوراکی بر بهبود پارامترهای اصلی مایع منی مانند غلظت اسپرم، تحرک، مورفولوژی، آسیب DNA  و میزان باروری در مردان نشان دادند که مکمل‌هایی مانند CoQ10  و آلفا توکوفرول به‌طور قابل توجهی تعداد اسپرم را بهبود می‌بخشند. همچنین، کارنیتین اثرات مثبتی بر تحرک و مورفولوژی اسپرم دارد و تجویز همزمان ویتامین E و ویتامین C آسیب DNA  اسپرم را کاهش می‌دهد، با این حال، در برخی مطالعات، یک یا چند عامل به طور قابل توجهی تغییر نکرده‌ بودند (30) که ممکن است توجیهی بر یافته‌های مطالعه حاضر باشد.

نتیجه‌گیری
استفاده از ویتامین C و عصاره هیدروالکلی برزک در پیشگیری از تغییرات هیستوپاتولوژیک بافت بیضه موش‌های صحرایی تحت مواجهه با استات سرب با دوز 50 میلی‌گرم بر کیلو‌گرم به مدت 35 روز مؤثر نبود که ممکن است به علت دوز بالای استات سرب، طول دوره درمان و بدنبال آن اثر آنتی‌اکسیدانی اسید‌آسکوربیک و تخم کتان خنثی شده باشد. این مطالعه گامی مهم در درک محدودیت‌های درمان‌های آنتی‌اکسیدانی رایج در مواجهه با سمیت فلزات سنگین در دوزهای بالا است.

تقدیر و تشکّر
این مقاله اقتباس از پایان‌نامه خانم سحر مصلح قهفرخی تحت عنوان "بررسی تأثیر عصاره هیدروالکلی تخم کتان (برزک) Linum Usitatissimum L.)) بر تغییرات هیستوپاتولوژیک بیضه و شاخص‌های باروری موش‌های صحرایی نر در معرض سرب"، در مقطع دکترای حرفه‌ای دامپزشکی در سال 1402 با کد پروپوزال ۱۶۲۷۲۶۲۴۱ است.
از پژوهشکده فن‌آوری تولید‌مثل دانشگاه شهرکرد و آقای دکتر ابراهیم احمدی تشکر و قدردانی می‌گردد.

ملاحظات اخلاقی
مطالعه حاضر پس از تأیید شورای پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد و کمیته اخلاق با کد IR.IAU.SHK.REC.1402.046 انجام شد.

حمایت مالی
این تحقیق هیچ‌گونه کمک مالی از دانشگاه یا سازمان‌های تأمین مالی در بخش خصوصی یا تحقیقاتی را دریافت نکرد.

مشارکت نویسندگان
رها مصلح: تأمین مالی پروژه تحقیقاتی.
عبدالرسول نامجو: انجام کارهای عملی،استخراج داده‌ها، تجزیه و تحلیل داده‌ها، نوشتن مقاله و ویرایش نهایی مقاله.

تضاد منافع
نویسندگان مقاله اعلام می‌دارند که هیچ گونه تضاد منافعی در پژوهش حاضر وجود ندارد.