مقاله کوتاه

بررسی جمعیت‏شناختی مولکولی و حساسیت دارویی سودوموناس آئروژینوزای جداشده از بیماران بستری در بیمارستان‏های آموزشی زابل

فروغ حیدری[1]، زهرا راشکی قلعه‌نو[2]

چکیده

زمینه و هدف: سودوموناس آئروژینوزا، یکی از مهم‏ترین عوامل عفونت‏های بیمارستانی است که سالانه جان بیماران بسیاری را تهدید می‏کند. با توجه به توانایی ذاتی و اکتسابی این باکتری در ایجاد مقاومت به بسیاری از عوامل ضدّ میکروبی، شناسایی الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی در کنترل مناسب آن اهمیت بالایی دارد. همچنین بررسی الگوی ژنتیکی ایزوله‏ها، در مدیریت عفونت‏های ناشی از این باکتری ضروری است. هدف از این مطالعه، بررسی تشابه ژنتیکی و مقاومت آنتی‌بیوتیکی ایزوله‏های سودوموناس آئروژینوزا با استفاده از نشانگر مولکولی RAPD-PCR بود.

روش تحقیق: این مطالعه توصیفی- مقطعی، با هدف بررسی الگوهای ژنتیکی و مقاومت آنتی‌بیوتیکی ایزوله‏های سودوموناس آئروژینوزای جمع‌آوری‌شده از بیمارستان‏های آموزشی زابل انجام شد. مقاومت آنتی‌بیوتیکی 100 ایزوله بالینی با روش انتشار دیسک و الگوهای ژنتیکی با روش RAPD-PCR بررسی شد.

یافته‌ها: نشانگر ملکولی RAPD-PCR، درجه بالایی از چندشکلی را در میان ایزوله‏های سودوموناس آئروژینوزا در منطقه سیستان نشان داد؛ همچنین بین حساسیت آنتی‌بیوتیکی و الگوی تنوّع ژنتیکی، هیچ‌گونه ارتباطی مشاهده نشد.

نتیجه‌گیری: یافته‏های به‌دست‌آمده از این مطالعه نشان می‏دهد که دندروگرام‌‌ حاصل از RAPD-PCR، بیانگر کارآیی بالای این روش در مطالعه جمعیت‏شناختی ایزوله‏های سودوموناس آئروژینوزا در منطقه سیستان است.

واژه‌های کلیدی: سودوموناس آئروژینوزا؛ مقاومت آنتی‌بیوتیکی؛ RAPD-PCR

مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی بیرجند. 1394؛ دوره 22 (4): 386-391 .

دریافت: 21/12/1393             پذیرش: 04/12/1394

مقدمه

 باکتری سودوموناس آئروژینوزا، از خانواده Pseudomonadaceae است که به‌عنوان سوّمین عامل شایع عفونت‌های بیمارستانی شناخته می‌شود (1). این باکتری به‌دلیل داشتن مقاومت‌های چندگانه به آنتی‌بیوتیک‌های مختلف، نامطلوب شناخته شده است و می‌تواند در بیماران بستری‌شده در بخش‌های مهم بیمارستانی مانند: بخش‌های سوختگی و مراقبت‌های ویژه، عفونت‌های ثانویه ایجاد کند (2).

ژنوم سودوموناس، بیشترین تنوّع را در بین باکتری‌ها داراست. تنوع ژنتیکی باکتری سودوموناس آئروژینوزا به‌علت توانایی سازگاری با میزبان‌ها و محیط‌های مختلف، واکنش‌های فنوتیپی متفاوتی ایجاد می‌کند. بنابراین برای شناسایی آن نمی‌توان فقط به تست‌های فنوتیپی اکتفا کرد؛ هر چند که روش فنوتیپی، روش دقیقی برای تشخیص می‌باشد (3). در بین روش‌های مولکولی، روش
RAPD-PCR روش قابل اعتمادی است که با صحّت بسیار بالا و به‌طور موفقیت‌آمیزی در طبقه‌بندی و تعیین ارتباطات ژنتیکی بسیاری از ارگانیزم‌ها از جمله: قارچ‌ها، ویروس‌ها و گونه‌های سودوموناس مورد استفاده قرار می‌گیرد (4). با در نظر گرفتن تنوّع بالای گونه‌های سودوموناس در ایران و نیز پراکندگی آنها در مناطق مختلف کشور و عدم آگاهی و شناخت کامل از میزان تشابه ژنتیکی در بین ایزوله‌های سودوموناس آئروژینوزا، ضرورت انجام تحقیق روشن ‌گردید.

روش تحقیق

در این مطالعه توصیفی- مقطعی، تعداد 527 نمونه از خون، زخم، ترشحات ریه، خلط و ادرار از بخش‌های مختلف بیمارستان‌های آموزشی از ابتدای سال 1391 تا پایان سال 1392 جمع‌آوری گردید.

برای شناسایی سودوموناس آئروژینوزا، ابتدا نمونه‌ها بر روی محیط‌های ستریماید آگار و مک‌کانکی آگار کشت داده شد و به‌مدّت 24 ساعت در دمای °C37 گرماگذاری گردید. سپس کلنی‌های رشدیافته برای انجام تست‌های تشخیصی و افتراقی از قبیل: رنگ‌آمیزی گرم، اکسیداز، کاتالاز، تست IMViC، توانایی حرکت و تولید پیگمان، توانایی تخمیر قندها در محیط  TSIو رشد در دمای °C42، مورد آزمایش و ارزیابی قرار گرفت. تعیین مقاومت آنتی‌بیوتیکی به‌روش دیسک‌دیفیوژن (Kirby-Bauer) و بر اساس استانداردهای CLSI انجام شد (5). دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی مورد استفاده (شرکت پادتن طب) شامل: سیپروفلوکساسین، ایمی‌پنم، پیپراسیلین، سفتازیدیم، سفکسیم، توبرامایسین و پلی‌میکسین B بود که به‌فاصله 4/2 سانتی‌متر از یکدیگر (مرکز تا مرکز دیسک دیگر) روی محیط مولر هینتون آگار جاگذاری و به‌مدّت 24-18 ساعت در دمای °C37 گرماگذاری شد. قطر هاله عدم رشد اطراف هر دیسک اندازه‌گیری و نتایج آن ثبت گردید. از سویه سودوموناس آئروژینوزا 9027ATCC به‌عنوان کنترل مثبت و از آب مقطر به‌عنوان کنترل منفی استفاده گردید.

برای استخراج DNA ژنومی، ابتدا ایزوله‌های سودوموناس آئروژینوزا در محیط(TSA)  Triptocase Soy Agar به‌مدت 24-18 ساعت در دمای °C37 گرماگذاری گردید. سپس چند کلنی باکتری در 200 میکرولیتر آب مقطر استریل به‌صورت سوسپانسیون در آمد. سوسپانسیون به‌مدّت 15 دقیقه در دمای °C100 جوشانده شد. پس از سانتریفیوژ، محلول رویی حاوی DNA برای انجام PCR در دمای °C20- ذخیره گردید.

واکنش RAPD-PCR با استفاده از دو پرایمر تهیه‌شده از شرکت پیشگام انجام شد. برای انجام فرآیند PCR، آنزیم 2×Master Mix RED از شرکت پیشگام خریداری شد. در این واکنش 2 میکرولیتر از DNA الگو، 5/12 میکرولیتر از 2×Master Mix RED و یک میکرولیتر از پرایمر
208:ACGGCCGACC و پرایمر
272: AGCGGGCCAA (20 پیکومول در میکرولیتر)، با یکدیگر مخلوط و حجم نهایی با آب مقطر دو بار تقطیر به 25میکرولیتر رسانده شد. برنامه اجرایی سیکل‌های PCR واجد مراحل زیر بود: واسرشتگی اولیه (Denaturation) در دمای °C95 به‌مدّت 5دقیقه و سپس 30 سیکل تکثیر شامل: واسرشتگی در دمای °C94 به‌مدّت 60 ثانیه، اتصال پرایمرها به DNA الگو در دمای °C36 به‌مدّت 60 ثانیه، طویل‌شدن رشته الگو (Extension) به‌مدّت 120 ثانیه در دمای °C72 و طویل‌شدن نهایی (Final extension) به‌مدت 5دقیقه در دمای °C72. پس از انجام واکنش، 5 میکرولیتر از محصولات واکنش در ژل آگارز 2% به‌مدّت 80دقیقه تحت تأثیر ولتاژ 75 الکتروفورز شد و قطعات تکثیر شده با استفاده از نشانگر Ladder 100  ارزیابی شد.

یافته‌ها

در این مطالعه، 100 نمونه سودوموناس آئروژینوزا پس از کشت در محیط مولر هینتون آگار و انجام تست‌های بیوشیمیایی، تعیین هویّت شدند. نمونه‌های مختلف بالینی شامل: 61 مورد (61%) از لوله تراشه، 21 مورد (21%) از ادرار، 3 مورد (3%) از مدفوع، 8 مورد (8%) از خلط و 7 مورد (7%) از خون جداسازی شد. از تعداد 100 ایزوله سودوموناس آئروژینوزا، 11% به ایمی‌پنم، 7% به سیپروفلوکساسین، 15% به سفتازیدیم، 98% به سفکسیم، 4% به توبرامایسین و 7% به پیپراسیلین مقاوم بودند (جدول 1). نتایج حاصل از
 RAPD-PCRنشان داد که تمامی ایزوله‌های تحت مطالعه، با هر دو پرایمر مورد استفاده قابل تایپ بودند.

به طور کلی آنالیز شکل‌ها و دندروگرام حاصل از آنها )شکل 1 (نشان داد که در هر دو پرایمر مورد استفاده، تمامی ایزوله‌ها در 17 کلاستر مجزا قرار داشتند و هر کدام حاوی چندین نمونه سودوموناس آئروژینوزا بودند. کلاسترهای F و K بیشترین ایزوله را داشتند؛ در حالی که کلاستر N دارای دو ایزوله بود. نتایج حاصل از  RAPD-PCR نشان داد که با استفاده از دو پرایمر طراحی‌شده، تمامی ایزوله‌ها از هم مجزا شده و الگوی متفاوتی را نشان دادند که خود نشانگر تمایز بالای این پرایمرها و در عین حال پلی‌مورفیسم ایزوله‌های مورد مطالعه است.

جدول 1- درصد فراوانی سویه‌های سودوموناس آئروژینوزای مقاوم به آنتی‌بیوتیک‌های مختلف

بحث

امروزه روش‌های مولکولی برای شناسایی و تمایز بین میکروارگانسیم‌ها بسیار کارآمدتر و مؤثّرتر از روش‌‌های فنوتیپی و کلاسیک قدیمی می‌باشند. در این بین، روش ملکولی RAPD-PCR به‌دلیل ویژگی‌هایی مانند: سریع و کم‌هزینه‌بودن، برخورداری از حساسیّت زیاد و عدم نیاز به‌ مهارت تکنیکی بالا، مورد توجه می‌باشد؛ به طوری که در چندین مورد از اپیدمی‌های باکتریایی، توانسته‌اند با این روش منبع آلودگی را پیدا کنند (6).

در این مطالعه، تشابه ژنتیکی سویه‌های سودوموناس آئروژینوزای جداشده از بیماران بستری در بیمارستان‌های زابل مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که هر دو پرایمر به کار رفته در این مطالعه، به‌طور قابل قبول عمل کردند؛ زیرا هیچ‌یک از دو ایزوله‌ها، الگوی باندی
 صد در صد مشابهی نداشتند.

در مطالعه‌ای که در کشور اسپانیا بر روی تنوّع ژنتیکی نمونه‌های سودوموناس آئروژینوزا توسط روش MLST و آنالیز درخت فیلوژنی انجام گرفت، تنوّع بالایی حدود 99-100 درصد مشاهده شد (7). در مطالعه‌ای که در تهران با عنوان بررسی تنوع ژنتیکی نمونه‌های سودوموناس آئروژینوزا توسط روش RAPD-PCR انجام شد، میزان شباهت ژنتیکی نمونه‌ها 40-100 درصد بود (8). در مطالعه حاضر میزان شباهت ژنتیکی 5-80 درصد بود که هیچ‌‌یک از صد نمونه، صد در صد به هم شبیه نبودند. در مطالعه‌ای که بر روی 573 ایزوله سودوموناس آئروژینوزا انجام شد، مشاهده شد که 90درصد متعلّق به گروه‌های مشابهی بودند (9). در مطالعه‌ای با همین عنوان، میزان تنوّع ژنتیکی بالایی توسط آنالیز درخت فیلوژنی مشاهده شد که می‌تواند نتایج این مطالعه را تأیید کند (10).

نتایج حاصل، نشان‌دهنده بیشترین مقاومت آنتی‌بیوتیکی به سفکسیم (98%) و کمترین مقاومت به توبرامایسین، پیپراسیلین و سیپروفلوکساسین به‌ترتیب: 4%، 7% و 7% بود. در یک مطالعه در برزیل مشاهده شد که ایمی‌پنم بیشترین فعالیت را بر ضدّ سودوموناس آئروژینوزا دارد و سیپروفلوکساسین در درجه دوم قرار داشت (11).

نتیجه‌گیری

بر اساس یافته‌های این مقاله، استاندارد کردن روش RAPD-PCR و تهیه بانک‌های اطلاعاتی از الگوهای ژنومی، مقایسه سریع و دقیق سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا را در بین آزمایشگاه‌های مختلف امکان‌پذیر می‌کند و در تشخیص سریع آغاز یک اپیدمی و ردیابی منشأ آلودگی و در پی آن مدیریت کنترل عفونت اهمیت دارد. از این رو مطالعه حاضر از یک طرف با فراهم‌کردن اطلاعاتی در مورد تشابه ژنتیکی سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا و از طرف دیگر با بهینه‌سازی روش RAPD-PCR و نشان دادن توانایی دو پرایمر طراحی‌شده در تایپینگ این باکتری، در توسعه این دیدگاه و به‌کارگیری آن در مدیریت بهداشتی کشور حائز اهمیت می‌باشد.

تقدیر و تشکر

بر خود لازم می‌دانیم از کلّیه عزیزانی که ما را در انجام این تحقیق یاری دادند، تقدیر و تشکر نماییم.

منابع:

1- Yong D, Choi YS, Roh KH, Kim CK, Park YH, Yum JH, et al. Increasing prevalence and diversity of metallo-beta-lactamases in Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., and Enterobacteriaceae from Korea. Antimicrob Agents Chemother. 2006; 50(5): 1884-6.

2- Fournier D, Richardot C, Muller E, Robert-Nicoud M, Llanes C, Plesiat P, et al. Complexity of resistance mechanisms to imipenem in intensive care unit strains of Pseudomonas aeruginosa. J Antimicrob Chemother. 2013; 68(8): 1772-80.

3- Ktari S, Mnif B, Znazen A, Rekik M, Mezghani S, Mahjoubi-Rhimi F, et al. Diversity of beta-lactamases in Pseudomonas aeruginosa isolates producing metallo-beta-lactamase in two Tunisian hospitals. Microb Drug Resist. 2011; 17(1): 25-30.

4- Tafvizi F, Tajabadi ebrahimi M, Heydari Nasrabadi M, Bahrami H. Detection of genetic diversity of lactobacillus species isolated from different traditional dairy products by RAPD markers. New Cell Mol Biotech J. 2011; 1(3): 33-42. [Persian]

5- Franklin R, Cockerilli, Matthew A. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Second Informational Supplement, M100-S22; Clinical and laboratory Standard Institute; 2012; Vol. 31; No 1.

6- Nucci C, da Silveira WD, da Silva Correa S, Nakazato G, Bando SY, Ribeiro MA, et al. Microbiological comparative study of isolates of Edwardsiella tarda isolated in different countries from fish and humans. Vet Microbiol. 2002; 89(1): 29-39.

7- Gomila M. Emergence of carbapenemases in Pseudomonas aeruginosa: a worldwide problem. Expert Rev Anti Infect Ther. 2013; 12(1): 9-11.

8- Taheri D, Talebi A, Taghaodi M, Fesharakizadeh M, Mortazavi M, Azhir A, et al. Pathological diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allograft without c4d staining, how much reliable? Adv Biomed Res. 2012; 1: 40.

9- Römling U, Wingender J, Müller H, Tümmler B. A major Pseudomonas aeruginosa clone common to patients and aquatic habitats. Appl Environ Microbiol. 1994; 60(6): 1734-8.

10- Ruimy R, Genauzeau E, Barnabe C, Beaulieu A, Tibayrenc M, Andremont A. Genetic diversity of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from ventilated patients with nosocomial pneumonia, cancer patients with bacteremia, and environmental water. Infect Immun. 2001; 69(1): 584-8.

11- Sader HS, Mallick R, Kuznik A, Fritsche TR, Jones RN. Use of in vitro susceptibility and pathogen prevalence data to model the expected clinical success rates of tigecycline and other commonly used antimicrobials for empirical treatment of complicated skin and skin-structure infections. Int J Antimicrob Agents. 2007; 30(6): 514-20.