آیدا سهیلی[1]، جواد بهارآرا[2]، ناصر مهدوی شهری[3]، سعیده ظفر بالانژاد[4]، الهه امینی[5]
چکیده
زمینه و هدف: ستاره شکننده، دارای ترکیبات فعال زیستی بوده که به آنها توانایی ترمیم زخم و بازسازی بازوها و اندامهای آسیبدیده را میبخشد. هدف از مطالعه حاضر، ارزیابی اثر حفاظتی عصاره تام ستاره شکننده خلیج فارس بر آسیب کبدی القا شده توسط تتراکلرید کربن در موش صحرایی بود.
روش تحقیق: در این مطالعه تجربی، 32 سر موش صحرایی نر بالغ نژاد ویستار بهصورت تصادفی به 4 گروه مساوی شامل: گروه کنترل، آسیب کبدی، تیمار شده با عصاره 25% و تیمارشده با عصاره 50% ستاره شکننده (به مدت هفت روز) تقسیم شدند. گروه آسیب کبدی فقط تتراکلرید کربن mg/kg5/0 بهمدّت هفت روز دریافت نمودند. در پایان، حیوانات کشته شدند و پس از توزین بدن و کبد، مقاطع بافت کبد تهیه و توسط میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفت. دادهها با استفاده از نرمافزارهای SPSS (ویرایش 20) و Mini Tab و با کمک آزمونهای آماری ANOVA و Tukey، در سطح 001/0P< تجزیه و تحلیل شدند.
یافتهها: تیمار با تتراکلرید کربن، موجب کاهش معنیدار وزن بدن و افزایش وزن کبد شد (001/0P<) و آسیب شدید کبدی در مقاطع بافتی کاملاً مشهود بود. در مقابل، تیمار با غلظتهای عصاره تام ستاره شکننده؛ افزایش وزن کبد، کاهش وزن بدن و تغییرات القا شده توسط تتراکلرید کربن بر ساختار بافت کبد همچون: تعداد هپاتوسیت، کوپفر و عروق را بهصورت معنیداری تغییر داد که نمایانگر بهبود ساختار بافت آسیبدیده کبد بود (001/0P<).
نتیجهگیری: عصاره تام ستاره شکننده میتواند اثر حفاظتی بر آسیب القا شده توسط تتراکلرید کربن در کبد داشته باشد.
واژههای کلیدی: ستاره شکننده، تتراکلرید کربن، آسیب کبدی، اثر محافظتی، موش صحرایی
مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی بیرجند. 1394؛ 22 (4): 316-326 .
دریافت: 07/11/1393 پذیرش: 04/09/1394
مقدمه
کبد، اندام مرکزی برای تجزیه، سمزدایی و دفع مواد زاید و مضر از بدن است (1). در اکثر موارد، طی عمل سمزدایی، فعالسازی میکروزومهای کبدی متابولیکی توسط آنزیمهای سیتوکروم P450 باعث ایجاد متابولیتهای ثانویه سمّی و فعال میشود که این مواد میتوانند موجب آسیب بافتهای مختلف از جمله کبد شوند (2، 3). رادیکالهای آزاد طی مراحل بیوشیمیایی در طی متابولیزم طبیعی بدن تولید میشوند؛ هر چند میتوانند منشأ خارجی نیز داشته باشند (2). در صورت توقف روندهای کنترل، رادیکالهای آزاد میتوانند برای سلول و در نتیجه بافت، بسیار مخرّب باشند. آنتیاکسیدانها موادی هستند که رادیکالهای اکسیژن را بهوسیله غیرفعالشدن ویژه از نظر زمانی و غلظتی، تحت کنترل نگه میدارند (3). آنتیاکسیدانها در مقادیر اندک میتوانند غشاهای سلولی و ترکیبات مختلف موجود زنده را در مقابل اکسیدانها حفظ کنند (4).
ستاره شکننده، جانوری است از شاخه خارپوستان که قادر به زندگی بر روی صخرههای سنگی و آهکی و صخرههای مرجانی کمعمق مناطق حارّهای است و به تعداد فراوان در این زیستگاهها یافت میشود (5، 6). این جانور با ایجاد اپیتلیوم مجدّد، قدرت ترمیم زخم را دارد؛ بهطوریکه بازسازی اولیه را با داربودن توالی پروتئینهای ریبوزومی و تکثیر سلولی در محل آسیبدیده، بازسازی متوسط را با تشکیل بلاستما و در نهایت بازسازی پیشرفته را با تکوین یک بازوی کوچک، انجام میدهد (7، 8). ترکیبات موجود در مایع سلومیک، غنی از ملکولهایی پپتیدی، فاکتورهای رشد و نوروپپتیدهایی است که در فرآیندهای سیگنالینگ توأم، شرکت دارند؛ همچنین دارای پپتیدهای فعال زیستی، هورمونها، عوامل رشد و پپتیدهاست که دارای خاصیت ایمنولوژیک، شناسایی سمّیت و شناسایی موادی است که در واکنش انعقادی ضروری هستند؛ از طرفی ملکولهای لکتین، پرفورین، آگلوتین و سیتوکینین در ستاره شکننده وجود دارد که موجب خنثیشدن و یا از بینبردن مواد خارجی، ترویج مهاجرت و آگلوتیناسیون سلولی شده و در مکانیسم ترمیم زخم حائز اهمیت است. ساپونین و ترکیبات ساپونینی و گلیکوزیدهای استروئیدی نیز از جمله ترکیباتی است که خاصیت ضدّ عفونیکننده، ضدّ قارچی و ضدّ پاتوژنی داشته و در ستاره دریایی به وفور وجود دارند (9). مشخص شده است که در خانواده خارپوستان، ترکیباتی مانند: سرآمید، بنیانهای هیدروکسیل، استیل و اسیدهای چرب وجود دارد که در ترمیم زخم مؤثّرند (10). ستاره شکننده، ترکیبات آلی آبگریز سمّی مانند: بیفنیلهای پلیکلرینه و هیدروکربنهای آروماتیک چندحلقهای دارد که انتظار میرود فعالیتهای زیستی متعدّدی را موجب شود (11). هدف از این تحقیق، بررسی اثر حفاظتی عصاره تام ستاره شکننده خلیج فارس
(Ophiocoma erinaceus) بر آسیب کبدی القا شده توسط تتراکلرید کربن (CCL4) در موش صحرایی بود.
روش تحقیق
در این مطالعه تجربی، ستاره شکننده از سواحل قشم در خلیج فارس جمعآوری شد. پس از انتقال ستارههای شکننده به آزمایشگاه تحقیقاتی مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوینی جانوری دانشگاه آزاد مشهد، در آنجا مورد شناسایی قرار گرفت و در فریزر 80- سانتیگراد نگهداری شد. در آزمایشگاه، نمونهها با آب مقطر شستشو داده شد و در اتاق تاریک در دمای 40 درجه سانتیگراد به مدت سه روز خشک و سپس پودر گردی (12). بهازای هر گرم وزن خشک بدن، 10میلیلیتر متانول مطلق به نمونهها اضافه شد. سپس نمونهها بهمدت 72ساعت، در تاریکی بر روی شیکر چرخشی قرار گرفت. پس از طی زمان مورد نظر، عصاره، 2 ساعت رفلاکس (عصارهگیری برگشتی) شده و با استفاده از کاغذ واتمن 10 صاف شد. در نهایت عصارهگیری توسط دستگاه وکیوم تبخیری (Heidolph, Germany) انجام شد؛ عصارهها تغلیظ گردید؛ درون آون 40درجه سانتیگراد خشک و در دمای 20- درجه سانتیگراد قرار داده شد (12).
32سر موش صحرایی نر نژاد ویستار، از مرکز سرمسازی رازی مشهد تهیه شد. موشها در اتاق حیوانات آزمایشگاهی، در شرایط استاندارد نوری (12 ساعت نور و 12 ساعت تاریکی)، رطوبت 60-40% و دمای 2±24 درجه سانتیگراد، در قفسهای استاندارد (با در نظرگرفتن تمهیدات لازم برای جلوگیری از ایجاد عفونت) قرار گرفتند. در کلیه مراحل مطالعه، مقررات اخلاق زیستی کار با حیوانات آزمایشگاهی زیر نظر کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی مشهد رعایت گردید (13). سپس حیوانات بهصورت تصادفی به 4 گروه مساوی تقسیم شدند.
گروه شاهد: (کنترل منفی) که هیچگونه تیماری روی آن صورت نگرفت.
گروه شاهد آزمایشگاهی: گروه کنترل مثبت که در آنها القای سیروز کبدی با استفاده از تتراکلرید کربن و 50% روغن زیتون بهمقدار 5/0میلیلیتر/کیلوگرم وزن بدن بهصورت داخل صفاقی، روزانه بهمدت 7 روز انجام شد. برای حصول اطمینان از القای آسیب، تعدادی موش در روز 7 کشته شده و تعدادی تا روز 14 نگهداری شدند.
گروه تجربی 1: در این گروه، القای سیروز کبدی با تتراکلریدکربن و 50% روغن زیتون بهمقدار 5/0میلیلیتر/کیلوگرم وزن بدن بهصورت داخل صفاقی، هر روز یک مرتبه بهمدت 7 روز انجام شد. همچنین موشهای این گروه، با استفاده از عصاره ستاره شکننده با دوز 25میلی گرم/کیلوگرم وزن بدن، بهصورت درونمعدهای بهمدت 7 روز گاواژ شدند.
گروه تجربی 2: در این گروه، القای سیروز کبدی با تتراکلریدکربن و 50% روغن زیتون بهمقدار 5/0میلیلیتر/کیلوگرم وزن بدن بهصورت داخل صفاقی بهمدت 7 روز انجام شد. همچنین موشهای این گروه، با استفاده از عصاره ستاره شکننده با دوز 50میلیلیتر/کیلوگرم وزن بدن بهمدت 7 روز گاواژ شدند (14).
برای بررسی ابتدا، وزن تمام موشها با ترازوی دیجیتال اندازهگیری شد؛ پس از القای آسیب کبدی با تتراکلرید کربن (بهصورت تزریق داخل صفاقی بهمدت 7 روز) نیز دوباره وزن بدن در تمامی گروهها اندازهگیری شد. در گروه شاهد، موشها با اتر کشته شدند؛ کبد آنها از بدن، خارج و وزن آن با استفاده از ترازوی دیجیتال (Sartorius, Canada) اندازهگیری شد. در گروههای تجربی 1 و 2 نیز پس از تیمار موشها با دوزهای 25 و 50 میلی گرم/کیلوگرم وزن بدن از عصاره تام ستاره شکننده، بعد از 7 روز دوباره وزن بدن و وزن کبد آنها با ترازوی دیجیتال اندازهگیری شد (15). برای بررسی ساختار بافتی موشهای گروه شاهد آزمایشگاهی القاشده با تتراکلرید کربن (بعد از 7 تا 14 روز) و موشهای گروههای تیمار با دوزهای 25 و 50 میلی گرم/کیلوگرم وزن بدن عصاره تام ستاره شکننده (بعد از 14 روز (7 روز برای ایجاد آسیب با تتراکلرید و 7 روز برای ترمیم آسیب با عصاره) (تجربی 1 و تجربی 2)، موشها با اتر کشته شدند؛ بدن آنها از ناحیه شکم برش داده شد و کبد آنها از داخل بدن خارج گردید. سپس برای بررسی تعداد هپاتوسیتها، تعداد سلولهای کوپفر و تعداد عروق خونی، نمونهها پس از شستشو در محلول سرم فیزیولوژیکی، به ظروف محتوی فیکساتور فرمالین 10% برای تثبیت بهمدت 24 ساعت انتقال داده شدند و مراحل آبگیری به کمک درجات صعودی اتانول 50، 70، 80، 96 و 100 درصد صورت گرفت. سپس نمونه ها در زایلن، شفافسازی شدند. در مرحله بعد، نمونهها به حمام پارافین منتقل و پس از تثبیت، قالبگیری انجام شد. مقاطع بافتی با ضخامت 7-5 میکرون تهیه و با روش هماتوکسیلین- ائوزین رنگآمیزی گردیدند. هستهها بنفش، سیتوپلاسم و کلاژن و کراتین صورتی تا قرمز شدند (16).
تجزیه و تحلیل آماری به کمک نرمافزارهای آماری SPSS (ویرایش 20) و Mini Tab، با کمک آزمونهای آماری ANOVA و Tukeyصورت گرفت. 001/0P< بهعنوان سطح معنیداری در نظر گرفته شد (3، 15).
یافتهها
مقایسه میانگین وزن بدن در ابتدا، بعد از یک هفته (پیشتیمار با تتراکلرید کربن) و در انتهای دو هفته (پس از تیمار با عصاره ستاره شکننده)، در جدول و نمودار یک و وزن کبد در جدول و نمودار 2 ارائه شده است. نتایج مطالعه حاضر نشان داد که وزن بدن در طول دوره پیشتیمار با تتراکلریدکربن در مقایسه با حیوانات کنترل، کاهش معنیداری داشت (001/0P<). این در حالی است که تیمار با عصاره تام ستاره شکننده با دوزهای 25 و 50 میلیگرم/کیلوگرم در حیوانات تیمارشده با تتراکلرید کربن، کاهش وزن ناشی از تتراکلریدکربن را بهصورت معنیداری جبران نمود. وزن کبد در حیوانات پیشتیمار با تتراکلریدکربن در مقایسه با حیوانات کنترل، افزایش معنیداری را نشان داد؛ در مقابل، تیمار با ستاره شکننده در حیوانات، تحت تأثیر تتراکلرید کربن، افزایش وزن کبد را بهصورت معنیداری کاهش داد (001/0P<).
جدول 1- مقایسه میانگین وزن ابتدا، هفته اول (پیش از تیمار) و هفته دوم (پس از تیمار) بعد از مداخله در گروههای مورد مطالعه
سطح معنیداری |
تجربی 2 |
تجربی 1 |
شاهد آزمایشگاهی |
شاهد |
گروهها |
>05/0 |
94/3±13/142 |
60/4±63/141 |
92/3±75/139 |
86/9±125/137 |
وزن بدن در ابتدا |
<001/0 |
13/6±13/129 |
03/11±25/127 |
06/5±13/122 |
56/ 8± 25/144 |
وزن بدن بعد از هفته اول |
<001/0 |
75/12±75/151 |
83/11±75/143 |
75/12±25/110 |
65/9±177 |
وزن بدن بعد از هفته دوم |