مجله علمی دانشگاه

کنترل برهمکنش نانومواد با سیستم‌های زیستی چالش اساسی و بنیادی در نانوپزشکی می‌باشد. پس از ورود نانومواد به محیط فیزیولوژیک، سطح آن‌ها فوراً به وسیله لایه‌ای از پروتئین‌ها پوشانده می‌شود که با عنوان پروتئین کرونا[1] شناخته می‌شود (1). کرونا پروتئین اندازه، پراکندگی، پایداری، و خواص نانومواد را تغییر می‌دهد و باعث تغییر مشخصه زیستی آن‌ها می‌شود. این تغییر، تعیین کننده پاسخ فیزیولوژیکی به واسطه برهمکنش نانومواد با مولکول‌های زیستی، غشاها، و موانع فیزیکی می‌باشد (2). مشخصه زیستی یک نانوماده، تابعی از مشخصه سینتتیک (اندازه، شکل، و شیمی سطح)، محیط فیزیولوژیکی و مدت زمان در معرض قرارگیری با محیط است. خون، اغلب اولین محیط فیزیولوژیکی است که نانومواد پس از تزریق با آن مواجه می‌شوند و پلاسما حاوی بیش از هزار پروتئین با قابلیت اتصال به نانومواد و تشکیل کرونا پروتئین می‌باشد (4, 3). پروتئین‌ها می‌توانند در شکل طبیعی یا دناتوره شده بسته به بار سطحی، میزان آب‌گریزی و پایداری ذاتی به سطح نانوذرات متصل شوند. این خواص نانوذرات است که واکنش‌های خودساماندهی پروتئین را تحت تأثیر قرار داده و سبب انحرافاتی در فرآیندهای زیستی یا منجر به بیماری‌هایی در ارتباط با تاخوردگی نادرست پروتئین‌ها می‌شود (8-5). با این وجود، طراحی نانوذرات مختلف با توجه به هدف و کاربرد مورد نظر می‌بایست با دقّت انجام گردد تا از واکنش‌های ناخواسته جلوگیری شود.

پیشرفت‌های اخیر در مطالعه کرونا پروتئین نشان می‌دهد که مشخصه‌های کرونا پروتئین و فراوانی نسبی آن‌ها ماهیتی پویا دارند (10, 9). برای برخی از نانوذرات، ماهیت پویای کرونا پروتئین به عوامل مختلفی بستگی دارد که شامل: 1. طیف بسیار وسیعی از تمایلات اتصال و ثابت‌های تعادلی پروتئین‌ها برای سطح نانوذره، که طیف وسیعی از زمان بقای پروتئین‌ها را بر روی سطح به دنبال دارد (11)، 2. تغییرات در سرعت اتصال/ تفکیک پروتئین-پروتئین (12) و 3. تغییرات در پروفایل پروتئینی سیالات زیستی (12). در طی برخورد نانوذرات با سیالات زیستی، ابتدا پروتئین‌هایی با فراوانی بالا بر سطح نانوذره جذب می‌شوند. این پروتئین‌ها سریعاً جدا شده و با پروتئین‌هایی با فراوانی کم ولی تمایل اتصالی بالاتر و سینتیک‌های تبادلی آهسته‌تر جایگزین می‌شوند (14, 13)؛ پدیده‌ای که اثر ورومن[2] نامیده می‌شود (16, 15). این اثر حداقل یکی از مکانیسم‌های اصلی و زیربنایی پروفایل‌های پروتئینی مختلف در کرونا نسبت به سیال زیستی اطراف نانومواد است (تصویر 1)(18, 17, 9).
انواع گوناگونی از نانو مواد تاکنون مورد بررسی قرار گرفته‌اند که دارای مشخصه‌های فیزیکی و شیمیایی متفاوتی هستند؛ به همین جهت واکنش‌های مختلفی را در بدن ایجاد می کنند. پس مشخصه‌یابی نانوذرات و بررسی پایداری آن‌ها در محیط بسیار اهمیت دارد که این موارد تابعی از روش سنتز می‌باشد (19). برخلاف سطوح ماکروسکوپی، نانوذرات می‌توانند تقریباً به هر نقطه‌ای از بدن موجود زنده بروند و بیومولکول‌ها از محیط قبلی‌شان در کرونا پروتئین آن‌ها باقی بماند؛ پروفایل پروتئینی همراه نانوذرات نمایانگر مسیرهایی است که نانوذره تا نقطه هدف طی کرده است. در این راستا، به دلیل اهمیت ساختار کرونا پروتئین در سرنوشت زیستی نانوذرات و دسترسی آن‌ها به بافت مورد نظر، در این مقاله، مروری بر نحوه تشکیل کمپلکس های پروتئین-نانوذره، روش‌های مشخصه‌یابی و اهمیت درمانی آن خواهیم داشت.

پروتئین کرونایی که بر روی سطح نانوذرات تشکیل می‌شود با قرارگیری در معرض یک محیط زیستی به دلیل داشتن ماهیتی پویا، در تبادل پیوسته با محیط اطراف خواهد بود. فرآیندهای سینتیکی در تبادل پروتئین‌ها بین سطح نانوذره و پلاسما، بین سطح نانوذره و سطح سلول (شامل گیرنده‌های اختصاصی)، و نیز نانوذرات و مولکول‌های پروتئینی آزاد با تمایل بالا در بدن برای اتصال به سطح سلول با هم رقابت کنند (20, 1). در شرایطی که اصلاح شیمیایی بر سطح نانوذره انجام شده باشد، جذب ترکیبات از محیط، حدفاصلی را ایجاد می‌کند که عامل تعیین کننده کلیدی در مسیر هدف‌گیری نانوذرات می‌باشد. از آنجا که برخی ترکیبات تا زمان پردازش هدف زیستی بر سطح نانو ذرات باقی می‌مانند و نقش مهمی را در تعیین سرنوشت نانو ذرات ایفا می‌کنند پس مسئله تمایلات نسبی همه ترکیبات سیستم باید به درستی مورد مطالعه قرار گیرد (21). رفتار نانوذره در آزمایشگاه و بدن نشان می‌دهد که برهمکنش بین نانوذرات و پروتئین‌های پلاسما و نیز دیگر اجزاء سازنده خون یکی از فاکتورهای تعیین کننده اصلی در سرنوشت نانوذرات هستند. لایه پروتئینی جذب شده نه تنها بر جذب سلولی و انتقال درون‌سلولی اثر می‌گذارد، بلکه اتصال اختصاصی پروتئین‌ها، ورود ذره و توزیع زیستی در بدن را تحت تأثیر قرار می‌دهد (25-22).
چندین فاکتور از قبیل اندازه، انحناء سطحی و ماهیت شیمیایی، چگونگی قرارگیری بیومولکول‌ها بر سطح نانوذره را تعیین می‌کنند (29-26). با این وجود، تعیین سرعت‌های اتصال، تمایلات ترکیبات، و استوکیومتری اتصال و تفکیک پروتئین در سیالات زیستی بسیار پیچیده می‌باشد که به دلیل حضور انواع بسیاری از پروتئین‌ها در غلظت‌های مختلف و رقابت آن‌ها برای اتصال به سطح نانوذره است (30, 21). سطوح نانومواد به دلیل نسبت سطح به حجم بالا، انرژی آزاد زیادی نسبت به مواد توده‌ای آن‌ها دارند. این بدان معنی است که سطوح نانوذرات به‌تدریج و به‌طور انتخابی در تماس با سیالات زیستی پیچیده، بیومولکول‌ها را جذب خواهند کرد. تشکیل کرونا از این بیومولکول‌ها، انرژی سطحی نانوذره را پائین آورده و پراکندگی آن را القا می‌کند (32, 31, 29) .
در بسیاری از موارد این کرونا پروتئین است که با سیستم‌های زیستی وارد برهمکنش می‌شود و به موجب آن عنصر مهمی از مشخصه زیستی نانوذره را تشکیل می‌دهد. برای چندین نانوذره، از قبیل طلا (33)، پلی استیرن (34, 20)، سیلیکا (35, 34, 26, 20)، تیتانیا (35) و اکسید روی (35)، تک لایه‌ای از بیومولکول‌ها (کرونای سخت) به سختی به سطح نانوذره متصل شده که این اتصال به طور کامل غیرقابل برگشت نمی‌باشد. بر روی این کرونای سخت، لایه‌ای با اتصالات ضعیف تشکیل می‌شود و به سرعت در حال تبادل با بیومولکول‌ها است که به آن کرونای نرم می‌گویند (37, 36, 34, 33, 20). مشاهده شده است که تنها تعداد کمی از بیومولکول‌های دردسترس در محیط زیستی، در کرونای سخت یافت می‌شوند. از این گذشته این پروتئین‌ها متعلق به فراوان‌ترین پروتئین‌ها در پلاسما می‌باشند و الزاماً بیشترین تمایل را به سطح نانوذره ندارند (42-38, 26, 17). همان طور که کرونای سخت به طور مشخص پایدار است (36, 34, 33, 26, 20)، تماس نانوذره با محیطی جدید با بیومولکول‌های متفاوت می‌تواند منجر به جابجایی کرونای سخت اصلی با مولکول‌های جدید شود (44, 43). بیومولکول‌هایی که جایگزین نمی‌شوند به عنوان حافظه کرونایی محیط قبلی نانوذره عمل می‌کنند؛ بنابراین ترکیب پروتئین کرونا نمی‌تواند بالقوه به محیط اخیر نانوذره بستگی داشته باشد، بلکه تحت تأثیر همه محیط‌هایی است که از آن عبور کرده است. (تصویر 2) (45, 44).

جذب پروتئین نیازمند برهمکنش مستقیم با سطح نانومواد نمی‌باشد؛ بلکه می‌تواند از طریق برهمکنش پروتئین- پروتئین انجام شود که به‌‌طور اختصاصی یا غیراختصاصی رخ می‌دهد. مطالعات نشان داده است که تشکیل سریع کرونا پروتئینی به دنبال قرار گرفتن نانوذره در معرض سیال زیستی و به دلیل افزایش انتروپی کل پروتئین‌ها هنگام جذب روی سطوح نانوذره صورت می‌گیرد (46). به غیر از پروفایل پروتئینی در محیط زیستی حاوی نانوذرات، تشکیل کرونا پروتئینی به طور قابل توجهی تحت تأثیر خواص فیزیکی و شیمیایی ذاتی نانوذرات قرار می‌گیرد. ترکیب شیمیایی ذره، اندازه، شکل، همراه با خصوصیات سطحی از قبیل گروه‌های عاملی سطحی، بار سطحی و آب گریزی و نیز صافی سطح و انحنا، تعیین می‌کنند که کدام پروتئین‌ها و چگونه با نوع خاصی از ذرات واکنش دهند. با این وجود، مشخصه سینتتیک نانوذرات می‌بایست به طور دقیق تعیین گردد تا بتوان به فعالیت زیستی مورد نظر دست یافت.
 

هدفمندی رویکردی است که به منظور افزایش اختصاصیت اثر درمانی برای هدف مورد نظر انجام می‌شود و بنابراین عوارض جانبی مرتبط با تجمع غیراختصاصی در دیگر اندام‌ها یا اجزاء سلولی کاهش می‌یابد. پس این راهکار باید به گونه‌ای طراحی گردد تا توانایی گریز از سیستم ایمنی را به منظور افزایش زمان گردش ذره هدفمند و دسترسی خودبه‌خودی به فرایندهای انتقال درون سلولی داشته باشد. راهکار رایج برای دستیابی به انتقال هدفمند در سطح سلولی، عامل‌دار کردن سطح نانوذره با بیومولکول‌هایی است که با گیرنده‌های اختصاصی بیان شده در سطح سلول وارد واکنش می‌شوند. مطالعات نشان می‌دهند که افزایش جذب نانوذرات در سلول‌ها به دنبال انتقال هدفمند و شناسایی گیرنده‌ سلولی خاصی رخ می‌دهد که منجر به جذب و رهایش دارو در ناحیه توموری خواهد شد. لیکن مکانیسم هدف‌گیری همیشه استفاده نمی‌شود و انتقال غیرفعال بدون نیاز به عامل هدف‌گیری انجام می‌شود، با توجه به این امر که رگ‌های تومور از لایه‌های اندوتلیال ناقص با روزنه‌های وسیع تشکیل شده‌اند (48, 47). در طراحی نانوذرات، تشدید جذب سلولی در بدن از طریق برهمکنش‌های اختصاصی گیرنده-لیگاند یا کنترل توزیع زیستی نانوذرات در بدن مورد توجه است که برای دستیابی به آن‌ها، پروتئین کرونا فاکتوری بنیادی و اساسی خواهد بود. با توجه به الزامات کرونا یا پدیده حدفاصل بیو-نانو برای هدف‌گیری نانوذرات و انتقال دارو دو رویکرد پیشنهاد می‌شود: 1. مهندسی سطح در ارتباط با طراحی حدفاصلی که حداقل برهمکنش‌ها را با محیط اطراف داشته و شناسایی و هدف‌گیری اختصاصی را انجام می‌دهد. 2. بهره‌وری از پروتئین کرونا برای هدف‌گیری، با درک این که پروتئین‌ها به طور مؤثری ذرات را به نقطه دلخواه انتقال می‌دهند. مطالعه‌ای کلیدی در این زمینه نشان داده است که دارا بودن پوشش سورفکتانت خاص (توئین 80) که به طور خودبه‌خودی به آپولیپوپروتئین E متصل می‌شود در انتقال دارو به مغز مؤثر بوده و به عنوان ذره‌ای با سطح مهندسی شده به طور اختصاصی عمل می‌کند (50, 49). در ارتباط با رویکرد دوم، نقش لایه‌های پروتئینی جذب شده در تعیین جذب نانوذره، انتقال و قرارگیری درون سلول بسیار شفاف‌تر شده است. در این راستا، اثر حضور پروتئین کرونا بر سطح نانوذرات پلی استیرن بر روی جذب نانوذرات به وسیله سلول‌های هپاتیک مورد بررسی قرار گرفته است (51). زمانی که نانوذرات در غیاب سرم در محیط کشت استفاده می‌شوند، جذب قابل توجهی مشاهده می‌شود؛ درحالی‌که در حضور سرم، جذب پروتئین‌ها به سطح نانوذره منجر به کاهش در انرژی سطحی و در نتیجه جذب کمتر نانوذرات می‌گردد. نانوذرات پلی استیرن که از قبل با آلبومین پوشانده شده‌ و در یک محیط بدون سرم قرار گرفته‌اند جذب کاهش یافته‌ای را نشان داده‌اند. این امر پیشنهاد می‌دهد حضور پروتئین‌ها از اتصالات غیراختصاصی نانوذرات به سطح سلول جلوگیری می‌کند (52). مطالعه مشابه دیگری تأیید کرد که سرعت‌های جذب بسیار متفاوتی در غیاب و حضور پروتئین‌های سرم در محیط مشاهده می‌شود و واضح است که تفاوت‌ها در ترکیب یا منبع پروتئین‌های سرمی می‌توانند اثرات قابل توجهی بر جذب نانوذرات داشته باشند (53). در نتیجه با توجه به اینکه پروتئین کرونا شدیداً در سرنوشت و تعیین مشخصه زیستی نانوذرات مؤثر می‌باشد و به دنبال آن اثرات درمانی و پاتوفیزیولوژیکی آن‌ها را تحت تأثیر قرار می‌دهد، طراحی خواص فیزیکی و شیمیایی نانوذرات در حین سنتز اهمیت پیدا می‌کند؛ چراکه عامل مهم و اصلی در ایجاد برهمکنش بین پروتئین‌های مختلف و سطح نانوذره می‌باشد. بررسی متون نشان می‌دهد که حضور پروتئین کرونا توانایی ممانعت از دستیابی نانوذره به ناحیه هدف و به دنبال آن تغییر سینتیک دارویی حامل و محموله دارویی آن را دارد.
تاکنون تلاش‌های زیادی در جهت شناسایی پروتئین‌هایی با تمایل بالا به سطح نانوذرات با ترکیبات یا خصوصیات سطحی متفاوت انجام شده است. هدف از این مطالعات پاسخ به این سوال می‌باشد که چطور اتصال پروتئین به نانوذرات می‌تواند برهمکنش آن‌ها با محیط زیستی را القا کند. برای مثال، جذب اپسونین‌ها (فیبرینوژن، ایمونوگلوبین G، فاکتور کمپلمان و غیره) همراه با اندازه‌های بزرگ (بیش از 200 نانومتر) فاگوسیتوز را برای حذف نانوذرات آغاز می‌کند (54, 52)، در حالی که اتصال دیس اپسونین‌ها (آلبومین، آپولیپوپروتئین‌ها، و غیره) و اندازه‌های کوچک ، زمان گردش در جریان خون را افزایش می‌دهد (51). سؤال دیگری که می‌بایست پاسخ داده شود این است که آیا لایه پروتئینی بر سطح نانوذره، اتصال به سلول‌ها را از طریق مکانیسم فعال اختصاصی انجام می‌دهد و یا این برهمکنش‌های غیراختصاصی با بیومولکول‌هاست که به عنوان پوشش ساده‌ای رفتار می‌کند و انرژی سطحی نانوذرات را کاهش می‌دهد. در مطالعه‌ای گزارش شده است که نانوذرات پلی استیرن با سطوح اصلاح شده متفاوت، کرونا پروتئین‌های اختصاصی مختلفی دارند؛ این منجر به ارتباط متفاوت ذرات با سلول‌های اندوتلیال نمی‌شود؛ بنابراین پیشنهاد می‌دهد که اتصال و جذب سلولی ممکن است به وسیله برهمکنش پروتئین با گیرنده‌های اختصاصی نباشد. در این مطالعه، فراوان‌ترین پروتئین‌ها از محیط کشت در طی تشکیل کرونا پروتئین حذف شدند که پروفایل پروتئین‌های جذب شده بر نانوذرات را تغییر می‌دهد؛ ولی سطح اتصال سلولی تحت تأثیر قرار نگرفت (55). به همین جهت ارزیابی ظرفیت جذبی نانوذرات می‌تواند به منظور پیش‌بینی میزان و توان برهمکنش‌های سلولی با نانوذرات بسیار کارآمد و سودمند باشد. مطالعه و درک برهمکنش‌های نانو-بیو می‌تواند بر محدودیت‌های موجود غلبه کرده و با اصلاح سطح و ساختار نانوذرات، اتصال پروتئین‌های اختصاصی در شرایطی کنترل شده مقدور خواهد بود. بررسی متون نشان می‌دهد که حضور کرونا پروتئین می‌تواند دو رخداد مختلف را در ارتباط با هدف‌گیری القا کند: 1. حضور برخی پروتئین‌ها مانند آپولیپوپروتئین‌ها موجب هدف‌گیری و عبور از سد خونی-مغزی می‌شود؛ درحالی‌که، 2. پوشش‌دهی سطح با پروتئین‌های مختلف می‌تواند موجب عدم دسترسی لیگاند به گیرنده اختصاصی شده و مانع هدف‌گیری نانوذرات گردد. این اثر متضاد در ارتباط با سمیت نانوذرات نیز مشاهده می‌شود. بسیاری از خواص سمیت نانوذرات از واکنش‌پذیری سطح آن‌ها با غشا سلولی منشاء می‌گیرد که حضور کرونا پروتئین می‌تواند آن را با کاهش واکنش‌پذیری تعدیل کند؛ اما در مقابل، جذب پروتئین‌ها بر سطح نانوذرات می‌تواند دناتوراسیون پروتئینی را القا کند که ممکن است موجب تحریک سیستم ایمنی‌ و پاسخ فیزیولیوژیکی نامطلوب گردد. همچنین شواهد نشان می‌دهد که تشکیل کرونا پروتئین توانایی افزایش نرخ ورود نانوذرات به درون ماکروفاژها و سلول‌های اندوتلیال را داشته و خطر سمیت سیتوپلاسمی و سیستمیک را بالا می‌برد (56).
براساس بحث بالا، در طراحی حدفاصل نانو-بیو برای انتقال هدفمند دارو، می‌توان چالش‌های موجود را به صورت زیر خلاصه کرد (تصویر 3):

تصویر 3- شمائی از چالش‌های نانوذرات هدفمند. a) نانوذره طراحی شده به همراه لیگاند هدفمند قبل از تماس با سیال زیستی؛ b) نانوذره پس از قرارگیری در سیال زیستی مثل پلاسما. لایه دینامیکی پروتئین‌ها و دیگر بیومولکول‌ها فوراً نانوذره را می‌پوشانند و پروتئین‌های با فراوانی بیشتر و تمایل کمتر با پروتئین‌های با فراوانی کمتر ولی تمایل بیشتر جابجا می‌شوند؛ c) استفاده از فاصله دهنده‌ها برای قرار گرفتن عامل هدف‌گیری بیرون کرونا مولکولی. در این مورد ممکن است ممانعت فضائی وجود داشته باشد که موجب کاهش کارایی برهمکنش لیگاند-گیرنده می‌شود و لیگاند ممکن است به نانوذره در جهتی نادرست متصل گردد؛ d) استفاده از پلیمرهایی مثل پلی‌اتیلن‌گلیکول می‌تواند به کاهش اتصال پروتئین به ذرات کمک کند و مانع تشکیل کرونا گردد؛ ولیکن، مسئله جهت لیگاند باقی می‌ماند و پلیمر ممکن است از اتصال همه پروتئین‌ها به نانوذرات جلوگیری نکند (26).

با توجه به اهمیت برهمکنش پروتئین‌های موجود در سیالات زیستی با نانوذرات مورد نظر که تعیین کننده سرنوشت زیستی نانوذره و توان درمانی آن می‌باشد، شناخت روش‌های آنالیتیک موجود در بررسی کرونا پروتئین بسیار ضروری است. از آنجائی‌که بیش از 3700 پروتئین در غلظت‌های مختلف وجود دارند و برای اتصال به سطح نانوذره رقابت می‌کنند، مطالعه برهمکنش پروتئین‌ها (تعیین سرعت‌های اتصال، تمایلات، استوکیومتری‌های اتصال پروتئین و غیره) با نانوذرات در سیالات زیستی بسیار پیچیده است؛ (3). تکنیک‌هایی از قبیل طیف سنجی مرئی-فرابنفش^[3] (UV-Vis)، طیف سنجی همبستگی فلورسانت^[4] (FCS)، تفرق دینامیک نور^[5] (DLS)، دورنگ نمایی دورانی^[6] (CD)، طیف سنجی انتقال فوریه مادون قرمز^[7] (FTIR) و کالریمتری تیتراسیون ایزوترمال^[8] (ITC) تنها برای مطالعه برهمکنش پروتئین منفرد با نانوذره کاربرد دارند؛ درحالی که بقیه تکنیک‌ها مثل کروماتوگرافی، الکتروفورز، طیف سنجی جرمی^[9] (MS)، پلاسمون رزونانس سطحی^[10] (SPR) و میکروبالانس کریستال کوارتز^[11] (QCM) می‌توانند برهمکنش بسیاری از پروتئین‌های دردسترس (پروتئوم) در محیط با نانوذره را مورد بررسی قرار دهند (57). رویکرد رایج مطالعه کرونا پروتئین، انکوباسیون نانوذرات در مخلوطی از پروتئین‌ها (مثل پلاسما یا سرم) برای دوره‌های مختلف زمانی (اغلب بین 10 دقیقه تا چند ساعت) و شستشوی پروتئین‌های متصل نشده با اولتراسانتریفوژ، کروماتوگرافی ستونی، یا تخلیص گرادیان دانسیته می‌باشد؛ ولیکن خطر از دست رفتن پروتئین‌های متصل در این شستشوها وجود دارد. کرونا پروتئین به وسیله پارامترهای مختلفی از قبیل ضخامت، دانسیته، شناسه پروتئینی، کمیت پروتئینی، تمایل پروتئین-نانوذره، آرایش پروتئینی، و شکل فضائی پروتئینی شناسایی می‌گردد (59, 58) اهمیت هر پارامتر و نیز تکنیک‌های مشخصه‌یابی برای هریک از آن‌ها در جدول 1 خلاصه شده‌اند.
 
سانتریفوژ
بیشتر مطالعات کرونا پروتئین با انکوباسیون نانوذرات درون پلاسمای خون آغاز می‌شود. در این روش، مدت زمان شستشو، تعداد مراحل، و حجم محلول می‌تواند بر لایه کرونا پروتئین اثر بگذارند. مشکل موجود در این روش این است که در طی سانتریفوژ پروتئین‌های با وزن مولکولی بالا و نیز رسوبات پروتئینی ممکن است ته‌نشین شوند و به اشتباه به عنوان کرونا پروتئین شناخته شوند؛ بنابراین، برای دقّت بیشتر، سانتریفوژ باید همراه با روش‌های دیگر از قبیل فیلتراسیون ژلی انجام شود (22).
 
دورنگ نمایی دورانی
ساختارهای ثانویه پروتئین مثل آلفا هلیکس و صفحات بتا طیف دو رنگ نمایی حلقوی خاص خود را در ناحیه فرابنفش دارند. روش CD به‌طور وسیعی برای پردازش تغییرات شکل فضائی القا شده با برهمکنش‌‎های پروتئین-ذره استفاده می‌شود. سیگنال CD میانگینی از اجتماع مولکولی کل را منعکس می‌کند؛ بنابراین، در حالی که CD تعیین می‌کند که به‌طور مثال یک پروتئین از حدود 50% آلفاهلیکس تشکیل شده است، قادر به تعیین انواع باقیمانده‌های اسیدآمینه‌ای خاص در آن نمی‌باشد. طیف CD یک پروتئین در ناحیه فرابنفش نزدیک می‌تواند به تغییرات کوچک در ساختار سوم به دلیل برهمکنش‌های پروتئین-پروتئین و یا تغییرات در شرایط حلال حساس باشد. اگرچه CD نمی‌تواند برای مخلوط پروتئین‌ها به‌کار رود، می‌تواند اطلاعات مفیدی درباره تغییرات ساختاری پروتئین جذب شده بر سطح نانوذره فراهم کند (60).
 
کالریمتری تیتراسیون ایزوترمال
این روش تکنیک کمّی است که می‌تواند پارامترهای ترمودینامیک را در محلول از قبیل تمایل اتصال، استوکیومتری اتصال و تغییر آنتالپی اتصال تعیین کند. هنگام تیتراسیون پروتئین در محلول نانوذره، تغییرات در دما اندازه‌گیری می‌شود. نشان داده شده است که این روش می‌تواند برای رسیدن به استوکیومتری و تمایل اتصال پروتئین استفاده گردد (61).
    

TEM: Transmission Electron Microscopy; SEC: Size-exclusion Chromatography; DCS: Differential Centrifugal Sedimentation; DLS: Dynamic Light Scattering; LC-MS/MS: Liquid Chromatography–Mass Spectrometry; PAGE: Polyacrylmide Gel Electrophoresis; CD: Circular Dichroism; ITC: Isothermal Titration Calorimetry; SPR: Surface Plasmon Resonance; QCM: Quartz Crystal Microbalance.(59).

[1] Protein corona

[3] Ultraviolet-visible spectroscopy

[12] Sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis

[13] Mass Spectrometry

[14] Nuclear magnetic resonance

[16] Differential Centrifugal Sedimentation