چکیده
زمینه و هدف: عفونت ویروس هپاتیت C (HCV) یک عامل خطر مهم در ایجاد سرطان کبد است. پروتئین غیرساختاری 3 (NS3) ویروس HCV که نقشی کلیدی در چرخه زندگی ویروس ایفا میکند، میتواند بر فعالیتهای طبیعی سلولی مانند: تکثیر سلول، مرگ سلولی و مسیرهای پیام رسانی سلولی تأثیر بگذارد همچنین شاید بتواند در ایجاد بدخیمی مؤثر باشد. از سوی دیگر دو ژن سلولی Heat Shock Protein 70 (HSP70) و Glypican3 (GPC3) که در این مطالعه ارزیابی میشوند، نقشهای مهمی در تنظیم مسیرهای پیامرسانی سلولی از جمله تکثیر سلولی دارند. هدف از این مطالعه، ارزیابی تأثیر پروتئین HCV NS3 بر بیان این دو ژن در مدل موش Balb / C بود.
روش تحقیق: در این مطالعه، سه گروه موش نر Balb / C، (n=8) در نظر گرفته شد: گروه اول که پلاسمید NS3 را دریافت کردند، گروه دوم که پلاسمید HBx ویروس هپاتیت B را دریافت کردند و گروه کنترل منفی که آب مقطر دریافت نمودند. دو تزریق از طریق ورید دم انجام شد و پس از آخرین تزریق، RNA از بافت کبد استخراج شد، سپس سنتز cDNA و Real Time PCR برای ژنهای مربوطه صورت گرفت.
یافتهها: نتایج نشان داد که بیان نسبی ژنهای انتخاب شده در گروه NS3 در مقایسه با گروه کنترل منفی معنیدار بود. (برای ژن GPC3، 0229/0=P و برای ژن HSP70، 0020/0=P) امّا تفاوت معنیداری بین گروه NS3 در مقایسه با گروه HBx وجود نداشت (برای ژن GPC3، 4516/0=P و برای ژن HSP70، 6740/0=P).
نتیجهگیری:
نتایج بهدست آمده نشان داد که NS3 شاید بر افزایش بیان ژنهای ذکر شده مؤثر باشد؛ امّا برای فهم دقیقتر، مطالعات بسیار بیشتری باید انجام شود؛ مانند: ارزیابی تأثیر NS3 بر سایر پروتئینهای درگیر در مسیرهای پیامرسانی سلولی، مطالعه سایر دومینهای NS3، انجام آزمایشهای پاتولوژیک و بافت شناسی، تغییر روشهای آزمایش، ارزیابی نقش NS4A به عنوان یک فاکتور برای NS3 و استفاده از وکتورهایی با پایداری بیشتر.
مقدمه
ویروس هپاتیت(HCV) C یک ویروس پوششدار دارای ژنوم RNA تک رشتهای با پلاریته مثبت میباشد که به خانواده Flaviviridae تعلّق دارد. عفونت HCV در جمعیت زیادی از بیماران مزمن مشاهده میشود و میتواند منجر به سیروز و هپاتوسلولار کارسینوما ([1]HCC) شود (1). ژنوم ویروس تقریباً 6/9 کیلو باز است که یک پیشساز پروتئین (تقریباً 3010 اسید آمینه) را کد میکند که توسط پروتئازهای میزبانی و ویروسی به پروتئینهای ساختاری core, E1, E2 و غیر ساختاری NS1(P7)، NS2، NS3، NS4A، NS4B، NS5A و NS5B پردازش میشود (2). [2]NS3 یک پروتئین ویروسی چند منظوره با 631 اسید آمینه است (3) و میتواند با پروتئینهای کنترل کننده چرخه سلولی و آپوپتوز واکنش دهد. نقش مؤثر پروتئین NS3 به عنوان یک عامل خطر برای پیشرفت سیروز و HCC مورد تأکید قرار گرفته است (4). HCC یک فرآیند پیچیده چند مرحلهای است که شامل فعال شدن انکوژنها، غیرفعالسازی ژنهای سرکوبگر تومور و تغییر در مسیرهای سیگنالینگ سلول است. این مسیرها شامل Hedgehog, Notch, WNT/β-Catenin, p53, pRb, TGF- β و غیره است (7-5). تعداد زیادی نشانگر بافتی و سرمی با تهاجم، متاستاز، عود و اهمیت تشخیصی HCC مرتبط هستند، مانند HSP70[3] و [4]GPC3 (8). GPC3 یک نشانگر بافت شناسی و سرولوژیکی است و بیان آن در HCC تا حدی اختصاصی است (9). انکوژنیسیته با واسطه GPC3 با تأثیرگذاری بر مسیر سیگنالینگی مانندIGF[5] است. همچنین مطالعه اثرات بیان GPC3 در ردههای سلولی HCC نشان داده است که این پروتئین با تحریک مسیر سیگنالینگ Canonical / Wnt باعث تحریک ایجاد سرطان کبد میشود (10).
HSP70 یکی از اعضای خانواده پروتئینهای شوک گرمایی است که در بیان آن در پاسخ به استرس فیزیولوژیک و پاتولوژیک از جمله تغییرات انکوژنز القا میشود (11). HSP70 ممکن است در فرآیند سرطانزایی شرکت کند و از طریق تنظیم مسیرهای آپوپتوتیک، تکثیر و بقای سلولهای توموری را تغییر دهد. بیان HSP70 در بدخیمیهای مختلف در انسان افزایش مییابد. یافتهها نشان میدهد که بیان آن در HCC بسیار افزایش مییابد (12). HSP70 میتواند نقش مهمی در پاتوژنز HCC مربوط به HCV داشته باشد (12 ,11).
پروتئین HBx یک پروتئین تحریک کننده رونویسی[6] است که توسط ویروس هپاتیت
B (HBV) کد میشود و میتواند در سرطان کبد نقش داشته باشد. HBx با اهداف مختلف میزبانی و با بسیاری از عملکردهای سلولی، از جمله تنظیم چرخه سلولی، آپوپتوز، سیگنالینگ، تنظیم رونویسی، مولکولهای چسبنده سلول، ژنهای سرکوب کننده تومور و انکوژن ها واکنش میدهد (13). مطابق با مقالات، HBx میتواند بیان HSP70 و GPC3 را افزایش دهد (17-13).
هدف از این مطالعه، ارزیابی اثر حضور پروتئین NS3 بر تغییر بیان دو ژن HSP70 و Glypican3 در حیوان آزمایشگاهی به منظور تعیین اثر NS3 بر روی این دو ژن درگیر در برخی از مسیرهای سیگنالینگ بود. از پلاسمید HBx برای مقایسه نتایج با گروه NS3 استفاده شد.
روش تحقیق
سازه های پلاسمیدی
پلاسمیدNS3
پلاسمید اصلی (gWiz) که بیان کننده پروتئین NS3 کامل با فعالیت پروتئازی است، به صورت هدیه از دکتر Gloria Gonzalez-Aseguinolaza (مرکز تحقیقات CIMA، ناوارا، اسپانیا) دریافت شد (تصویر 1). بیان پروتئین NS3 تحت کنترل پروموتر Cytomegalovirus(CMV)است و تأیید توالی و بیان آن قبلاً انجام شده است (18).
تصویر 1- نقشه ژنتیکی پلاسمید gwiz حاوی ژن NS3
پلاسمید HBx
این پلاسمید (PCAGGS / MCS) که HBx را بیان میکند، به صورت هدیه از دکتر Gloria Gonzalez-Aseguinolaza (مرکز تحقیقات CIMA، ناوارا، اسپانیا) دریافت شد. بیان پروتئین HBx تحت کنترل پروموتر chicken β actin است (تصویر 2).
تصویر 2- نقشه ژنتیکی پلاسمید PCAGGS / MCS حاوی ژن HBx
مدل حیوانی
موشهای نر Balb / c (6-8 هفتهای) از انستیتوی پاستور ایران (کرج، ایران) خریداری شده و به سه گروه 8 تایی تقسیم شدند. تمام آزمایشات بر اساس قوانین مربوط به مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی کمیته اخلاق پزشکی دانشگاه تربیت مدرس مصوب مورخه 19/11/92 با شماره نامه 6577 انجام شده است.
استخراج و تزریق پلاسمیدها
پس از استخراج پلاسمیدها از باکتری با استفاده از کیت استخراج پلاسمید NucleoBond® Xtra Midi kit شرکت MN آلمان، مرحله تزریق پلاسمیدها انجام شد. پس از ضد عفونی کردن دم با الکل، با استفاده از سرنگ انسولین، حداکثر مقدار 100 میکرولیتر با غلظت 25 میکروگرم در میکرولیتر به ورید دمی تزریق شد. تزریق دوم با همین کیفیت 7 روز بعد انجام شد. دو گروه موش یکی پلاسمید NS3 و دیگری پلاسمید HBx را دریافت کردند. گروه سوم نیز به عنوان کنترل منفی، آب مقطر دریافت نمودند. 6 روز بعد موشها کشته شده، بافت کبد خارج شده و بلافاصله در یک میلیلیتر محلول ترایزول در فریزر منفی 70 درجه سانتیگراد قرار داده شد.
استخراج RNA، ساخت cDNA و انجام Real Time PCR
RNA تام بافت کبدی با استفاده از محلول Trizole (Qiagen، آلمان) طبق دستورالعمل مربوطه استخراج شد و بعد سنتز cDNA با استفاده از کیت Thermo Scientific RevertAid شرکت فرمنتاز انجام گرفت. سپس، cDNA ها برای انجام Real-Time PCR استفاده شدند. جهت انجام این کار برای هر بار تست، مواد زیر به نسبتهای گفته شده در داخل ظروف 48 خانه ریخته و با یکدیگر ترکیب شدند. این مواد شامل: CYBER Green Master Mix (ABI, USA) به میزان 10 میکرولیتر، Forward primer به میزان 10 پیکومولار (5/0 میکرولیتر)، Reverse primer به میزان 10 پیکومولار (5/0 میکرولیتر)، cDNA به میزان 1 میکرولیتر و DEPC Water به میزان 8 میکرولیتر می باشند.
هر واکنش PCR با استفاده از PCR master mix (Applied Biosystems) و SYBER Green در دستگاه ABI Step One (Applied Biosystems, Sequences Detection Systems. Focter City, CA) طبق پروتکل شرکت سازنده انجام گرفت. 40 سیکل برای هر چرخه Real-Time PCR در نظر گرفته شد و دماهای هر سیکل شامل 94 درجه سانتیگراد برای 20 ثانیه، 60-58 درجه سانتیگراد برای 30 ثانیه و 72 درجه سانتیگراد برای 30 ثانیه تنظیم شدند. نسبت بیان ژنهای مورد بررسی در این مطالعه، با روش مقایسهای چرخه آستانه و مقادیر Cq مورد ارزیابی قرار گرفتند. با استفاده از قرار دادن دادهها در فرمول Cq∆∆ میزان بیان ژنهای هدف با ژن مرجع GAPDH نرمال سازی شد. اطلاعات مربوط به پرایمرهای استفاده شده برای GPC3، HSP70 و ژن GAPDH به عنوان ژن مرجع در جدول 1 ذکر شده است.
جدول1- ویژگیهای پرایمرهای استفاده شده
دمای Tm |
کد ژن در NCBI |
طول محصول |
توالی پرایمرها |
نام ژن |
60 |
NM_016697 |
368 |
FOR:5´-GGAGAGATACAGCCAGAAGGC-3´
REV:5´-AGGTGGTGATCTCGTTGTCC-3´ |
GPC3 |
60 |
NM_010479 |
79 |
FOR:5´-CGAGAGCCGGTCGTTCTTC-3´
REV:5´-CAGGTACGCCTCAGCGATCT-3´ |
HSP |
60 |
NM_001289726 |
178 |
FOR:5´-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC -3´
REV:5´-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3´ |
GAPDH |
تحلیل آماری
همانگونه که قبلاً بیان شد، هر گروه شامل 8 نمونه بود و دادهها حاصل SD±mean هستند. تحلیل آماری دادهها در نرم افزار Graphpad prism 9.0.0 و با آزمون Unpaired t test with Welch's correction انجام شد و جهت بررسی معنیداری، مقدار P value درسطح 0.05 P<در نظر گرفته شد. نمودارهای مربوطه نیز با نرم افزار Graphpad prism 9.0.0 رسم شدند.
یافتهها
نتایج بهدست آمده از مقایسه بیان ژنها در گروههای مختلف:
1. نمودار 1، میزان (نسبت) بیان دو ژن GPC3 و HSP70 را نشان میدهد؛ همان طور که پیش از این گفته شد، بیان این ژنها با ژن مرجع GAPDH نرمال سازی شده است. گروه NS3 و HBx به عنوان گروههای تیمار شده و گروه کنترل منفی به عنوان گروه تیمار نشده در نظر گرفته شدهاند و بر این اساس با استفاده از قرار دادن دادهها در فرمول Cq∆∆ میزان (نسبت) بیان ژنهای هدف نسبت به گروه کنترل منفی محاسبه شد.
مطابق نمودار 1، بیان ژن GPC3 در گروه دریافت کننده پلاسمید NS3، نسبت به گروه کنترل منفی، 49/8 برابر است؛ همچنین این میزان در گروه دریافت کننده پلاسمید HBx نسبت به گروه کنترل منفی نیز افزایش دارد (77/7 برابر).
2. طبق نمودار 1، بیان دیگر ژن مورد مطالعه یعنی ژن HSP70 در گروه دریافت کننده پلاسمید NS3، نسبت به گروه کنترل منفی، 41/8 برابر است. این افزایش بیان در گروه دریافت کننده پلاسمید HBx هم دیده میشود و نسبت به گروه دریافت کننده پلاسمید NS3 نیز بیشتر میباشد (88/8 برابر).
3. افزایش بیان هر دو ژن در گروه دریافت کننده پلاسمید HBx، با یافتههای مطالعات پیشین در خصوص تأثیر مثبت HBx در افزایش بیان این دو ژن مطابقت دارد.
4. در نمودار 2، مقادیر Cq∆ ((Cq(target)-Cq(reference) دو ژن GPC3 و HSP70 در گروه NS3 در مقایسه با کنترل منفی و HBx در مقایسه با کنترل منفی آورده شده است. همان طور که پیش تر ذکر شد، تفاوت معنیدار و افزاینده بیان ژنها در دو گروه NS3 و HBx در اینجا نیز مشهود است.
5. در نمودار 2، مقادیر Cq∆ دو ژن GPC3 و HSP70 در دو گروه دریافت کننده NS3 و HBx نیز با هم مقایسه شده است. مقایسه مقادیر Cq∆ ژن GPC3 در دو گروه دریافت کننده پلاسمید NS3 و HBx تفاوت معنیداری را نشان نمیدهد. همین نتیجهگیری درباره HSP70 نیز صادق است. در جدول 2، مقادیر P در گروههای مختلف آمده است.
نمودار 1- نسبت بیان ژنها در دو گروه NS3 و HBx
نمودار 2- مقایسه مقادیر Cq∆ در هر گروه NS3 و HBx نسبت به گروه کنترل منفی.
جدول 2- نسبت بیان ژنهادر گروه های مختلف
نام ژن |
مقادیرP |
گروه NS3 در مقایسه با گروه کنترل منفی |
گروه HBx در مقایسه با گروه کنترل منفی |
گروه NS3 در مقایسه با گروه HBx |
GPC3 |
0229/0 |
0126/0 |
4516/0 |
HSP70 |
0020/0 |
0022/0 |
6740/0 |
بحث
عفونت مزمن با ویروس هپاتیت C یک مشکل بهداشت جهانی است که به طور متوسط 150 میلیون نفر را در جهان گرفتار کرده است.HCV خطر ابتلا به سرطان کبد را با تحریک التهاب و فیبروز کبد آلوده افزایش میدهد و شواهد اپیدمیولوژیک هم ارتباط نزدیک و واضحی را بین عفونت HCV و سرطان کبد نشان میدهند. تغییرات مولکولی القاء شده بر اثر HCV در سلولهای آلوده، به شکل معناداری در گسترش و پیشرفت سرطان کبد، دخالت دارند (19). در یک مطالعه نشان داده شد که ویروس قادر به القای سلولهای بنیادی سرطانی در کشت سلول و تومورهای زنوگرافت موشی است (20).
در مطالعات مختلف، پروتئین NS3 ویروس به عنوان یک عامل مؤثر در تغییرات مسیرهای پیامرسانی و مولکولهای مختلف سلولی مورد توجه واقع شده است. اولین اثبات آزمایشگاهی تومورزا بودن NS3 توسط Sakamuro و همکاران در رده سلولی غیر توموری فیبروبلاست موشی (NIH 3T3) انجام شد (4). دو ژن انتخاب شده در این تحقیق، از نشانگرهای هپاتوسلولارکارسینوما محسوب میشوند. ژن GPC3، علاوه بر تحریک مسیرWNT/β-Catenin قادر است مسیر پیامرسانی IGF را با روشی اختصاصی فعال کند. این پروتئین میتواند سرطانزایی را از طریق واکنش بین IGF-II و گیرنده آن، تحریک کند که این یافتهها در فهم نقش GPC3 در سرطان کبد مهم هستند (21). همچنین NS3 قادر است مسیر پیامرسانی Notch را با اتصال به یک فاکتور رونویسی فعال کند (22). پروتئین NS3 به عنوان یک نشانگر بافتشناسی و سرولوژی کشف شد که بیان آن برای هپاتوسلولارکارسینوما اختصاصی است (9). دیگر ژن مورد بررسی، یعنیHSP 70 که یکی از نشانگرهای زودرس سرطان کبد به حساب میآید و در ارتباط با ایجاد سرطان کبد مرتبط با HCV میباشد. کمپلکس این پروتئین و HSP 40 با پروتئین NS5A ویروس در تولید ذرات ویروسی جدید نقش دارد (23).
نویسندگان هدف از مطالعه حاضر را ارزیابی اثر پروتئین NS3 بر تغییر بیان دو ژن HSP70 و Glypican3 در حیوان آزمایشگاهی عنوان کردهاند. از نظر داور محترم لازم بود نویسندگان پس از تزریق دوز دوم پلاسمید به حیوان آزمایشگاهی، میزان بیان پروتئین NS3 را در بافت کبد گروههای مختلف مورد سنجش قرار میدادند؛ اما این کار انجام نشده است. بنابراین نتیجهگیری عنوان شده از سوی نویسندگان در حد فرضیه باقی مانده و نمیتوان تغییرات بیان ژن را به پروتئین NS3 نسبت داد.
نتیجهگیری
در این تحقیق، در گروه دریافت کننده پلاسمید NS3 میزان بیان هر دو ژن GPC3 و HSP 70 نسبت به گروه کنترل منفی به طور معنیداری افزایش یافته است. شاید بتوان گفت پروتئین NS3، توانسته نقش تحریک کنندگی برای بیان این ژنها داشته باشد؛ اما این افزایش در مقایسه با گروه دریافت کننده پلاسمید HBx که به نحوی گروه کنترل مثبت به شمار میآیند، تفاوت معنیداری ندارد.
ذکر این نکته نیز ضروری به نظر میرسد که ما بیان ژنهای انتخاب شده را در سطح mRNA بررسی کردیم و تحقیقات تکمیلی، از جمله مطالعات آسیب شناسی و بافت شناسی بر روی بافت کبد (مانند مطالعات ایمونوهیستوشیمی) و مطالعه در سطح بیان پروتئین، به منظور درک بهتر و دقیقتر میتواند مفید باشد.
با توجه به نتایج به دست آمده درباره نقش پروتئین NS3 در این پژوهش و تحقیقات قبلی و لزوم بررسیهای بیشتر مکانیسمهای مولکولی دخیل در سرطان کبد بر اثر HCV، به نظر میرسد بررسی اثر NS3 بر سایر پروتئینهای دخیل در مسیرهای پیامرسانی مختلف به ویژه پروتئینهای ابتدایی هر مسیر، هم در کشت سلول و هم در مدلهای حیوانی، میتواند به درک مکانیسمهای ایجاد سرطان کبد و درمان آن کمک کند.
به منظور دستیابی به نتایج دقیقتر و بررسی بهتر صحت نتایج این تحقیق، تغییر در زمان خارج کردن کبد، تعداد دفعات تزریق، فواصل، غلظت و حجم تزریقات و بررسیهای بیشتر در شرایط کنترل شده سلولی و بالینی ضروری به نظر میرسد. هم چنین استفاده از وکتورهایی با قابلیت بیان طولانیتر و پایداری بیشتر در بدن موجود زنده، باعث افزایش دقّت و بهبود صحت نتایج فوق خواهد شد. نکته دیگری که بیان آن مفید به نظر میرسد این است که نقش کوفاکتوری پروتئین NS4A برای عملکرد NS3 بسیار مهم است. پیشنهاد میشود در مطالعات بعدی این مسئله لحاظ شود و از وکتوری که هر دو پروتئین را در بر دارد، استفاده شود.
تقدیر و تشکّر
این مقاله حاصل پایاننامه کارشناسی ارشد با کد ایران داک 2210749 در گروه ویروسشناسی دانشکده پزشکی دانشگاه تربیت مدرس میباشد.
تضاد منافع
نویسندگان مقاله اعلام میدارند که هیچ گونه تضاد منافعی در پژوهش حاضر وجود ندارد.
منابع:
1- Heim MH. Innate immunity and HCV. J Hepatol. 2013; 58(3): 564-74 DOI: 10.1016/j.jhep.2012.10.005
2- Hiscott J, Lacoste J, Lin R. Recruitment of an interferon molecular signaling complex to the mitochondrial membrane: disruption by hepatitis C virus NS3-4A protease.Biochem Pharmacol. 2006; 72(11): 1477-84. DOI: 10.1016/j.bcp.2006.06.030
3- He Q-Q, Cheng R-X, Sun Y, Feng D-Y, Chen Z-C, Zheng H. Hepatocyte transformation and tumor development induced by hepatitis C virus NS3 c-terminal deleted protein. World J Gastroenterol. 2003; 9(3): 474-8. DOI: 10.3748/wjg.v9.i3.474
4- Kasprzak A, Adamek A. Role of hepatitis C virus proteins (C, NS3, NS5A) in hepatic oncogenesis. Hepatol Res. 2008; 38(1): 1-26. DOI: 10.1111/j.1872-034X.2007.00261.x
5- Jeong SW, Jang JY, Chung RT. Hepatitis C virus and hepatocarcinogenesis. Clin Mol Hepatol. 2012; 18(4): 347-56. DOI: 10.3350/cmh.2012.18.4.347
6- Mikhail S, He AR. Liver Cancer Stem Cells. Int J Hepatol. 2011; 2011: 486954. DOI: 10.4061/2011/486954
7- Wang B, Jacob ST. Role of cancer stem cells in hepatocarcinogenesis.Genome Med. 2011; 3(2): 1-6. DOI: 10.1186/gm225
8- Singhal A, Jayaraman M, Dhanasekaran DN, Kohli V. Molecular and serum markers in hepatocellular carcinoma: Predictive tools for prognosis and recurrence. Crit Rev Oncol Hematol. 2012; 82(2): 116-40. DOI: 10.1016/j.critrevonc.2011.05.005
9- Shirakawa H, Kuronuma T, Nishimura Y, Hasebe T, Nakano M, Gotohda N, et al. Glypican-3 is a useful diagnostic marker for a component of hepatocellular carcinoma in human liver cancer. Int J Oncol. 2009; 34(3): 649-56. DOI: 10.3892/ijo_00000190
10- Filmus J, Capurro M. Glypican-3: a marker and a therapeutic target in hepatocellular carcinoma. FEBS J. 2013; 280(10): 2471-6. DOI: 10.1111/febs.12126
11- Takashima M, Kuramitsu Y, Yokoyama Y, Iizuka N, Toda T, Sakaida I, et al. Proteomic profiling of heat shock protein 70 family members as biomarkers for hepatitis C virus-related hepatocellular carcinoma. Proteomics. 2003; 3(12): 2487-93. DOI: 10.1002/pmic.200300621
12- Lagana SM, Salomao M, Bao F, Moreira RK, Lefkowitch JH, Remotti HE. Utility of an Immunohistochemical Panel Consisting of Glypican-3, Heat-shock Protein-70, and Glutamine Synthetase in the Distinction of Low-grade Hepatocellular Carcinoma From Hepatocellular Adenoma. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2013; 21(2): 170-6 10.1097/PAI.0b013e31825d527f. DOI: 10.1097/PAI.0b013e31825d527f
13- Azam F, Koulaouzidis A. Hepatitis B virus and hepatocarcinogenesis. Ann Hepatol. 2008; 7(2): 125-9. DOI: 10.1016/S1665-2681(19)31867-8
14- Ng S-A, Lee C. Hepatitis B virus X gene and hepatocarcinogenesis. J Gastroenterol. 2011; 46(8): 974-90. DOI: 10.1007/s00535-011-0415-9
15- Sun Q, Wang Y, Zhang Y, Liu F, Cheng X, Hou N, et al. Expression profiling reveals dysregulation of cellular cytoskeletal genes in HBx–induced hepatocarcinogenesis. Cancer Biol Ther. 2007; 6(5): 668-74. DOI: 10.4161/cbt.6.5.3955
16- Gouas DA, Shi H, Hautefeuille AH, Ortiz-Cuaran SL, Legros PC, Szymanska KJ, et al. Effects of the TP53 p.R249S mutant on proliferation and clonogenic properties in human hepatocellular carcinoma cell lines: interaction with hepatitis B virus X protein. Carcinogenesis. 2010; 31(8): 1475-82. DOI: 10.1093/carcin/bgq118
17- Xie H-Y, Cheng J, Xing C-Y, Wang J-J, Su R, Wei X-Y, et al. Evaluation of hepatitis B viral replication and proteomic analysis of HepG2. 2.15 cell line after knockdown of HBx. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2011; 10(3): 295-302. DOI: 10.1016/s1499-3872(11)60049-0
18- Khanlari Z, Sabahi F, Hosseini SY, Ghaderi M. HCV NS3 Blocking Effect on IFN Induced ISGs Like Viperin and IL28 With and Without NS4A. Hepat Mon. 2014; 14(6): e17822. DOI: 10.5812/hepatmon.17822
19- Vermehren J, Aghemo A, Falconer K, Susser S, Lunghi G, Zeuzem S, Colombo M, Weiland O, Sarrazin C. Clinical significance of residual viremia detected by two realtime PCR assays for response-guided therapy of HCV genotype 1 infection.J Hepatol. 2014; 60(5): 913-9. DOI: 10.1016/j.jhep.2014.01.002
20- Ali N, Allam H, May R, Sureban SM, Bronze MS, Bader T, et al. Hepatitis C virus-induced cancer stem cell-like signatures in cell culture and murine tumor xenografts. J Virol. 2011; 85(23): 12292-303. DOI: 10.1128/JVI.05920-11
21- Cheng W, Tseng C-J, Lin TTC, Cheng I, Pan H-W, Hsu H-C, Lee Y. Glypican-3- mediated oncogenesis involves the Insulin-like growth factor-signaling pathway. Carcinogenesis. 2008; 29(7): 1319-26. DOI: 10.1093/carcin/bgn091
22- Iwai A, Takegami T, Shiozaki T, Miyazaki T. Hepatitis C virus NS3 protein can activate the Notch-signaling pathway through binding to a transcription factor, SRCAP. PloS one. 2011; 6(6): e20718. DOI: 10.1371/journal.pone.0020718
23- Gonzalez O, Fontanes V, Raychaudhuri S, Loo R, Loo J, Arumugaswami V, Sun R, Dasgupta A, French S. The heat shock protein inhibitor Quercetin attenuates hepatitis C virus production. Hepatology. 2009; 50(6): 1756-64. DOI: 10.1002/hep.23232