Abstract                                                                                                                                                                        Original Article

Characterization of bla_CTX gene and Cross-resistance in Klebsiella pneumoniae Isolated from Hospitalized Patients

Gholamreza Pourali Sheshblouki[1]^,[2], Jalal Mardaneh[3]^*

Background and Aim: Klebsiella pneumoniae is a member of the Enterobacteriaceae family. There is a global emergence of multidrug-resistant (MDR) strains of K. pneumoniae, a Gram-negative enteric bacterium that causes nosocomial and urinary tract infections. The aims of the present study were to identify the Klebsiella pneumoniae infections in hospitalized patients, characterization of bla_CTX gene, detection cross-resistance and cefepime susceptible-dose dependent (SDD) in isolates.

Materials and Methods: In present study, 111 strains of Klebsiella pneumoniae were isolated from patients hospitalized in Ghotbadden, Faghihi and Nemazee hospitals (Shiraz, Iran). The isolates were identified as K.pneumoniae, based on biochemical tests embedded in the API-20E system. Susceptibility testing (disc diffusion) was performed according clinical and laboratory standards institute (CLSI) guidelines. Detection cefepime susceptible-dose dependent (SDD) was performed. The detection of AmpC β-lactamases producing strains was done based on cefoxitin and cefepime disk tests. The bla_CTX gene was detected in the isolates by PCR molecular method.

Results: Total 111 Klebsiella pneumoniae isolates were studied. The less effective drug was ceftazidime (37.8% isolates were sensitive). All SDD strains were susceptible to colistin and imipenem. Colistin (96.4%) and imipenem (88.3%) were the most effective antibiotics against isolates. Respectively, 41.4% and 35.1% isolates displayed resistance to gentamicin and amikacin. All colistin resistant isolates were imipenem sensitive. The results of PCR on bla_CTX gene showed that 70.3% of the isolates possess the gene.

Conclusion: Carbapenem drugs are effective against Klebsieella pneumoniae infections. These results indicate that multidrug-resistant (MDR) and extensively drug resistant (XDR) strains of K.pneumoniae are rising, and fewer antibiotics may be useful for treating infections caused by these strains. Routine investigation and reporting of antibiotics resistance profile in patients presenting with Klebsiella infections is suggested.

Key Words: Hospitalized patients, Blood, Bacterial infection, Klebsiella pneumoniae, Antibiotic resistance pattern, Susceptible-dose dependent.

Journal of Birjand University of Medical Sciences. 2016; 23 (1): 56-66.

Received: June 17, 2015                  Accepted: February 23, 2016

مقاله اصیل پژوهشی

شناسایی ایزوله‏های کلبسیلا پنومونیه دارای ژن bla_CTX و
 تعیین مقاومت متقاطع آنها در بیماران بستری در بیمارستان

غلامرضا پورعلی شش بلوکی[4]^،[5]، جلال مردانه[6]

چکیده

زمینه و هدف: کلبسیلا پنومونیه یکی از اعضای خانواده انتروباکتریاسیه است که سبب عفونت‏های بیمارستانی می‏شود. در حال حاضر، با ظهور سویه‏های مقاوم به چنددارو (MDR) این باکتری در جهان، روبرو هستیم. هدف از مطالعه حاضر جداسازی کلبسیلا پنومونیه از بیماران بستری در بیمارستان، شناسایی ایزوله‏های دارای ژن bla_CTX، تعیین Cross-resistance و شناسایی ایزوله‏های حساس وابسته به دوز (Susceptible-dose dependent (SDD)) نسبت به سفپیم بود.

روش تحقیق: در این مطالعه مقطعی، 111 سویه کلبسیلا پنومونیه از بیماران بستری در بیمارستان‏های قطب‏الدین، فقیهی و نمازی شیراز (ایران) جداسازی شدند. ایزوله‏ها بر اساس تست‏های بیوشیمیایی موجود در سیستم API20E به‌عنوان کلبسیلا پنومونیه شناخته شدند. تست حساسیت آنتی‏بیوتیکی با استفاده از روش دیسک‌دیفیوژن و پروتکل سازمان استانداردهای بالینی و آزمایشگاهی (CLSI 2014) انجام شد. ایزوله‏های حساس وابسته به دوز نسبت به سفپیم شناسایی شدند. شناسایی سویه‏های تولیدکننده AmpC β-lactamase با استفاده از دیسک‏های سفوکسیتین و سفپیم انجام گرفت. از روش ملکولی PCR برای شناسایی سویه‏های دارای ژن bla_CTX استفاده شد.

یافته‌ها: به‌طور کلی 111 ایزوله کلبسیلا پنومونیه، مورد مطالعه قرار گرفتند. کم‏اثرترین دارو سفتازیدیم (8/37 درصد ایزوله‏ها حساس بودند) بود. همه سویه‏های SDD حساس به ایمی‏پنم و کلیستین بودند. کلیستین (4/96%) و ایمی‏پنم (3/88%) مؤثّرترین آنتی‏بیوتیک‏ها بر ضدّ ایزوله‏ها بودند. میزان مقاومت به جنتامایسین 4/41 درصد بود.  نتایج انجام PCR به‌منظور جستجوی ژن bla_CTX در ایزوله‏های کلبسیلا پنومونیه نشان داد که 3/70 درصد سویه‏ها دارای این ژن بودند.

نتیجه‌گیری: این نتایج نشان داد که سویه‏های کلبسیلا پنومونیه مقاوم به چنددارو (MDR) و مقاوم به طیف وسیعی از داروها (XDR) در حال افزایش است و کمتر آنتی‏بیوتیکی ممکن است برای درمان عفونت‏های ناشی از این سویه‏ها مفید باشد.

واژه‌های کلیدی: بیماران بستری در بیمارستان، خون، عفونت باکتریای، کلبسیلا پنومونیه، الگوی مقاومت آنتی‏بیوتیکی، حساس وابسته به دوز

مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی بیرجند. 1395؛ دوره 23 (1): 56-66.

دریافت: 2703/1394                      پذیرش:  04/12/1394

مقدمه

کلبسیلا پنومونیه؛ باسیلی گرم منفی، دارای کپسول، غیر متحرّک و فاقد اسپور است که در خانواده باکتریایی انتروباکتریاسیه قرار دارد. این باکتری، یک پاتوژن فرصت‏طلب محسوب شده و به کلاس‏های مختلف آنتی‏بیوتیکی به‌کمک روش‏های مختلف، مقاومت نشان می‏دهد (1).

عفونت‏های ناشی از ایزوله‏های کلبسیلا پنومونیه- تولیدکننده آنزیم‏های غیرفعال‏کننده آنتی‏بیوتیک‏های کارباپنم یعنی کارباپنمازها- در حال گسترش در سراسر جهان بوده و سبب افزایش مرگ و میر در مبتلایان می‏گردد. مکانیسم مقاومت به کارباپنم‏ها بسیار حائز اهمیت هستند؛ زیرا اغلب به‌وسیله تست‏های غربالگری روتین قابل شناسایی نیستند و پتانسیل بالقوّه‏ای برای گسترش دارند. به‌دلیل محدود بودن انتخاب‏های درمانی، علاوه بر چالش‏های کنترل عفونت که در حال افزایش هستند، عفونت‏های ناشی از این ارگانیسم، پزشکان را با چالش‏های جدّی در درمان روبرو کرده است (1). انتروباکتریاسیه‏ها در بین عوامل ایجادکننده عفونت‏های بیمارستانی هستند. شناسایی سریع باکتری‏های تولیدکننده KPC به‌وسیله روش‏های آزمایشگاهی به‌منظور دست‏یابی به کنترل عفونت، بسیار حائز اهمیت است (2). 

کلبسیلا پنومونیه از جمله میکروارگانیسم‏های مسئول بسیاری از عفونت‏های حاد از جمله عفونت‏های گردش خون در بیماران بستری در بیمارستان است. ظهور سویه‏های با مقاومت به بسیاری از آنتی‏بیوتیک‏های وسیع‏الطیف شامل کارباپنم‏ها، یک مشکل جدّی در بیماران دارای بیماری شدید است (2، 3). مقاومت دارویی یک مشکل عمده در درمان بیماران مبتلا به بیماری‏های عفونی در تمام جهان است. انتروباکتریاسیه‏های مقاوم به کارباپنم‏ به‌ویژه کلبسیلا پنومونیه، به‌عنوان یک عامل مهم بروز عوارض و مرگ و میر در بین عفونت‏های اکتسابی از بیمارستان و عفونت‏های طولانی‌مدت مرتبط با مراقبت‏های بهداشتی مطرح است. به‌طور قابل توجهی مرگ و میر بسیار بالایی (30 تا 70 درصد) در بین بیماران مبتلا به باکتریمی یا عفونت‏های تنفسی ناشی از کلبسیلا پنومونیه تولیدکننده کارباپنمازها وجود دارد (4، 5).

در سال 2013، شیوع عفونت‏های بالینی کلبسیلا پنومونیه تخمین زده شده در ایالات متحده در بیمارستان‏های با مراقبت‏های طولانی‌مدت در مقایسه با واحد‏های مراقبت ویژه بیمارستانی کوتاه‌مدت، بالاتر بود (6). اگر چه کلبسیلا پنومونیه دارای میزان متوسطی از پنی‏سیلینازهای کروموزمی است، این ارگانیسم به‌خوبی به‌عنوان یک جمع‏کننده پلاسمیدهای مقاومت چنددارویی است (7). کسب پلاسمیدهای مقاومت و وقوع موتاسیون‏های کروموزومی که سبب بروز مقاومت به فلوروکینولون‏ها می‏شود، سبب می‏شود که اغلب درمان عفونت ناشی از کلبسیلا پنومونیه مرتبط با عفونت‏های مراقبت‏های بهداشتی، فقط به‌وسیله استفاده از کارباپنم‏ها به‌عنوان آخرین خط درمانی آنتی‏بیوتیکی انجام ‏شود (8). معمولاً کمتر آنتی‏بیوتیکی بر روی کلبسیلا پنومونیه تولیدکننده آنزیم KPC مؤثّر است و عفونت با این سوش، با مرگ و میر بالایی در بین بیماران مبتلا به عفونت‏های گردش خون مرتبط است. در حقیقت بسیاری از این سویه‏ها به کلیستین، تیگسیکلین و حداقل یکی از آمینوگلیکوزیدها حساس هستند؛ اما برخی از آنها حتی به این داروها نیز مقاوم هستند (6).

عفونت‏های ناشی از کلبسیلا پنومونیه تولیدکننده کارباپنماز، همراه با افزایش هزینه‏های درمانی و بستری‌شدن طولانی‌مدت در بیمارستان و شکست درمانی و مرگ و میر همراه خواهد بود. پیش‏آگهی ضعیفی از عفونت‏های ناشی از باکتری‏های گرم منفی تولیدکننده کارباپنماز گزارش شده است. در گزارشی از ایالات متحده آمریکا که بر روی عفونت‏های گردش خون ناشی از باکتری‏های تولیدکننده کارباپنماز در سال 2011 انجام شد، میزان مرگ و میر بیماران 47 تا 66 درصد بود (9). در بررسی دیگری نشان داده شد که خطر مرگ در بیماران مبتلا به عفونت‏های ناشی از این سویه‏ها 2 برابر افزایش داشت (9).

با توجه به استفاده گسترده از آنتی‏بیوتیک‏ها در ایران و افزایش خطر مقاومت دارویی و نیز با توجه به اینکه در ایران کمتر مطالعه‏ای بر روی باکتری کلبسیلا اکسی‏توکا انجام شده است، اهداف این مطالعه شامل: تعیین پروفایل مقاومت آنتی‏بیوتیکی در ایزوله‏های بالینی کلبسیلا اکسی‏توکا، شناسایی ایزوله‏های حساس وابسته به دوز[7] نسبت به سفپیم، مشخص‌نمودن مقاومت متقاطع[8] در بین ایزوله‏ها، بررسی توانایی تولید آنزیم AmpC-beta-lactamase و شناسایی ژن blaCTX کدکننده آنزیم بتالاکتاماز با استفاده از روش PCR در ایزوله‏ها بود.

روش تحقیق

در این مطالعه مقطعی که در طی یک سال-از فروردین تا اسفندماه سال 1393- انجام شد، نمونه‌های مختلف (خون، ادرار، خلط، زخم، تراشه) از بیماران بستری در بیمارستان‏های فقیهی، قطب‏الدین و نمازی شیراز جمع‏آوری شد. برای هر یک از افراد مورد بررسی، پرسشنامه تنظیم‌ و کد‏گذاری گردید. نمونه‌گیری از افراد، پس از مشخص‌نمودن هدف مطالعه برای آنها و کسب رضایت کتبی آگاهانه از هر یک از افراد تحت مطالعه، صورت پذیرفت.

جداسازی و شناسایی باکتری:

 ابتدا نمونه‏ها بر روی محیط‌های معمول میکروب‌شناسی شامل: محیط‌های بلاد آگار، شکلات آگار و مک‏کانکی آگار (Merck Co. Germany) کشت داده شدند؛ سپس نمونه‌ها در دمای 37درجه سانتی‏گراد به‌مدت یک شبانه‌روز انکوباسیون شده و از نظر رشد باکتری و تشکیل کلونی بر روی محیط‌ها مورد بررسی قرار گرفتند. باکتری‌های گرم منفی ایزوله‏شده از نمونه‌های ارسالی، به‌کمک تست‏های مورفولوژی و بیوشیمیایی اولیه شامل: رنگ‌آمیزی گرم، اکسیداز، کاتالاز و حرکت (Merck Co. Germany) و به‌دنبال آن با استفاده از تست‏های بیوشیمیایی تعبیه‌شده در سیستم API 20E اختصاصی انتروباکتریاسیه‏ها و به‌دست آوردن کد ارگانیسم و وارد نمودن کد در نرم افزار API، مورد شناسایی نهایی قرار گرفتند.

تعیین حساسیت ایزوله‏ها به آنتی‏بیوتیک‏ها:

در این مطالعه به کمک روش استاندارد دیسک‌دیفیوژن و بر اساس پروتکل ارائه‌شده توسط سازمان استاندارهای بالینی و آزمایشگاهی (CLSI 2014) (10) و استفاده از دیسک‌های
8 آنتی‏بیوتیک (Rosco, Danish) شامل: سفوکسیتین (FOX، 30μg)، آمیکاسین (AMI، 30μg)، سیپروفلوکساسین (CIP، 5μg)، سفتازیدیم (CAZ، 30μg)، سفپیم (CPM، 30μg)، جنتامایسین (GM، 10μg)، ایمی‏پنم (IMP، 10μg) و کلیستین (CO، 10μg)، حساسیت آنتی‏بیوتیکی سویه‌های جداشده مورد مطالعه قرار گرفت. در این روش با استفاده از نرمال‌سالین، رقّت 5/0 مک‏فارلند از باکتری تهیه گردید. سپس کشت بر روی محیط مولرهینتون آگار انجام شد. پس از انکوباسیون محیط‌ها در دمای 2±35 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 16 تا 18 ساعت، نتایج خوانده شدند.

شناسایی سویه‏های حساس وابسته به دوز:

 برای شناسایی ایزوله‏های SDD بر اساس پروتکل CLSI(2014)، از روش استاندارد دیسک‌دیفیوژن استفاده شد. سویه‏هایی که هاله عدم رشد 24-19 میلی‏متر در اطراف دیسک سفپیم داشتند، به‌عنوان SDD در نظر گرفته شدند.

شناسایی سویه‏های تولیدکننده AmpC-beta-lactamase با استفاده از تست فنوتیپی:

در این روش، از دیسک‏های آنتی‏بیوتیکی سفوکسیتین (FOX، 30μg) و سفپیم (CPM، 30μg) استفاده شد. ایزوله‏هایی که مقاوم به سفوکسیتین و حساس به سفپیم بودند، به‌عنوان AmpC-beta-lactamase positive
در نظر گرفته شدند. 

PCR Assay:

سویه‏های کلبسیلا پنومونیه مورد تأیید قرار گرفته، بر روی محیط TSA کشت داده شدند. پلیت‏ها به‌مدّت 18-16 ساعت در دمای 37 درجه‏سانتی گراد انکوبه شدند؛ سپس با استفاده از روشBoiling ، ژنوم ارگانیسم استخراج گردید. در روش Boiling یک میلی‏لیتر از کشت باکتری رشد کرده به‌صورت شبانه در محیط TSB در دمای 37 درجه سانتی‏گراد به‌مدت 4دقیقه در دور rpm1000 سانتریفیوژ شد. مایع رویی بیرون ریخته شد و رسوب به‌دست‌آمده در یک‌میلی‏لیتر
TE Buffer (mM Tris10، mM EDTA1، pH=7.8) حل و به‌طور مجدد سانتریفیوژ ‏گردید؛ سپس رسوب حاصله در 100 میکرولیتر TE Buffer حل شد. میکروتیوب در دمای 94 درجه سانتی‏گراد برای مدت 10دقیقه قرار داده شد؛ سپس به‌مدت 10دقیقه در rmp13000 سانتریفیوژ گردید. مایع رویی در میکروتیوب‏های کدگذاری شده ذخیره و به‌عنوان نمونه DNA در واکنش PCR مورد استفاده قرار گرفت. قبل از انجام PCR، نمونه DNA استخراج‌شده، به‌وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر و نیز بابردن بر روی ژل آگارز و انجام الکتروفورز و سپس مشاهده باند زیر نور UV، مورد ارزیابی قرار گرفت.

از پرایمرهای موجود در جدول یک برای انجام واکنش PCR استفاده شد. هر سیکل واکنش PCR شامل مراحل: Pre-denaturating در دمای 94 درجه سانتی‏گراد (5 دقیقه)، Denaturating در دمای 94 درجه سانتی‌گراد (30 ثانیه)، Annealing در دمای 62 درجه سانتی‌گراد (30 ثانیه) و تکثیر Extention در دمای 72 درجه سانتی‌گراد (30 ثانیه) بود و یک مرحله Post-extention در دمای 72درجه سانتی‌گراد به‌مدت 5 دقیقه اعمال ‏گردید. واکنش PCR در طی 30 سیکل انجام شد. محصول PCR با استفاده از آگارز یک‌درصد روی دستگاه الکتروفورز حاوی بافر 0.5X TAE، الکتروفورز شد و با استفاده از دستگاه ترانسلومیناتور به‌منظور جستجوی باند‏ 544bp، مورد آنالیز قرار گرفت. در طی این مطالعه از سویه‏های استاندارد K.pneumoniae ATCC 7881 به‌عنوان کنترل مثبت استفاده گردید.

جدول 1- پرایمرهای مورد استفاده جهت شناسایی ژن CTX با استفاده از PCR در ایزوله‏ها

آنالیز آماری:

 داده‌های به‌دست‌آمده، به‌کمک نرم‌افزار SPSS (ویرایش 19) مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت.

یافته‌ها

در این مطالعه 111 سویه کلبسیلا پنومونیه مورد بررسی قرار گرفت. آنالیز نتایج تست‏های تعیین حساسیت دارویی نشان داد که به‌ترتیب کلستین و ایمی‏پنم مؤثّرترین آنتی‏بیوتیک‏ها بر ضدّ ایزوله‏ها می‏باشند. در بین آنتی‏بیوتیک‏های کلاس بتالاکتام، سویه‏ها بهترین پاسخ را به نسل چهارم سفالوسپورین‏ها یعنی سفپیم (1/44%) نشان دادند. در کلاس داروهای آمینوگلیکوزیدی مورد بررسی، ایزوله‏ها بهترین پاسخ را به آمیکاسین نشان دادند. چهار ایزوله (6/3درصد سویه‏ها) به کلستین مقاومت نشان دادند (نمودار 1). در این مطالعه هیچ سویه مقاومت گسترده دارویی[9] مشاهده نشد.

در بررسی نتایج حساسیت دارویی نسبت به سفپیم بر اساس استانداردهای CLSI، در حدود 3/6درصد ایزوله‏ها (7سویه) حساس وابسته به دوز بودند که از این بین 5سویه به آنتی‏بیوتیک سیپروفلوکساسین مقاوم بودند و تنها یک سویه به همه داروهای مورد بررسی حساسیت نشان داد. 6سویه از 7سویه SDD، به آنتی‏بیوتیک‏های کلاس آمینوگلیکوزیدها

جدول 2- الگوی مقاومت آنتی‏بیوتیکی سویه‏های کلبسیلا پنومونیه SDD نسبت به سفپیم (7N=)

(جنتامایسین، آمیکاسین) حساست نشان دادند (جدول 2).

بررسی الگوی مقاومت متقاطع نشان داد که 3/33 درصد ایزوله‏ها به داروهای کلاس آمینوگلیکوزید‏های مورد بررسی مقاوم بودند. 2/7درصد سویه‏های کلبسیلا پنومونیه مورد مطالعه دارای مقاومت چنددارویی[10] بودند و به 3کلاس آنتی‏بیوتیکی بزرگ مورد بررسی یعنی سفالوسپورین‏ها، کارباپنم‏ها و کینولون‏ها پاسخ ندادند. 16 سویه (4/14درصد ایزوله‏ها)، همزمان به آمینوگلیکوزیدها (جنتامایسین، آمیکاسین) و کینولون‏ها (سیپروفلوکساسین) مقاوم بودند (جدول 3). نتایج انجام PCR به‌منظور جستجوی ژن bla_CTX در ایزوله‏های کلبسیلا پنومونیه نشان داد که 3/70درصد سویه‏ها دارای این ژن بودند (شکل 1). بررسی پروفایل حساسیت آنتی‏بیوتیکی ایزوله‏های کلبسیلا پنومونیه که دارای ژن bla_CTX بودند نشان داد که این ایزوله‌ها بیشترین مقاومت را به‌ترتیب به سفتازیدیم (9/85%) و سفپیم (6/84%) نشان دادند؛ همچنین این ایزوله‏ها بیشترین حساسیت را به کلیستین (2/96% سویه‏ها حساس بودند) نشان دادند (نمودار 2).

جدول 3- الگوهای Cross-resistance در ایزوله‏های بالینی کلبسیلا پنومونیه (111N=)

نمودار 2- پروفایل حساسیت آنتی‏بیوتیکی ایزوله‏های کلبسیلا پنومونیه که با استفاده از PCR، ژن blaCTX در آنها شناسایی شده است.

بحث

اگرچه توجه بسیاری از محققین به مقاومت آنتی‏بیوتیکی در ایزوله‏های بالینی جداشده از بیماران در بیمارستان‏ها و نیز باکتری‏هایی که به‌طور مستقیم اثر مخرّب بر روی سلامتی انسان دارند، می‌باشد؛ اما گسترش مقاومت به آنتی‏بیوتیک‏ها یک پدیده اکولوژیکی طبیعی است که حاصل بیلیون‏ها سال تکامل است. به‌دلیل استفاده وسیع از آنتی‏بیوتیک‏ها در جهان در بخش‏های مختلف از جمله: پزشکی، درمان حیوانات، کشاورزی، پرورش زنبور عسل و نیز صنایع نفت و دریایی و نیز استفاده در برخی از آزمایشگاه‏ها برای مطالعات و دستکاری‏های ژنتیکی، فشار تکاملی برای ظهور مقاومت آنتی‏بیوتیکی بسیار بالاست. بنابراین مطالعات بر روی گسترش مقاومت و مکانیسم‏های آن، باید ضرورتاً در مراحل اولیه کشف و استفاده از آنتی‏بیوتیک انجام شود (11-14). 

در مطالعه حاضر، مقاومت به آنتی‏بیوتیک‏های معمول مورد استفاده در درمان عفونت‏های ناشی از باکتری‏های گرم منفی، به‌نسبت بالا بود و بیشترین مقاومت‏، به بتالاکتام‏ها (2/62درصد مقاومت به سفتازیدیم، 6/58درصد به سفوکسیتین، 9/55درصد مقاومت به سفپیم) مشاهده شد؛ همچنین 3/33درصد ایزوله‏ها به آمینوگلیکوزیدها (جنتامایسین و آمیکاسین) و 3/33درصد به سیپروفلوکساسین مقاوم بودند.

مطالعات انجام‌شده در نقاط مختلف جهان نتایج متفاوتی از مقاومت به سیپروفلوکساسین را نشان داده‏اند؛ به‌طوری‌که در مطالعه Paterson و همکاران در سال 2000 بر روی سویه‏های کلبسیلا پنومونیه ایزوله‌شده از بیماران مبتلا به باکتریمی، 5/5درصد ایزوله‏های ایجادکننده باکتریمی، مقاوم به سیپروفلوکساسین بودند (15). در مطالعه‏ای در ترکیه، 42درصد ایزوله‏ها مقاوم به سیپروفلوکساسین بودند. همچنین در آرژانتین 15درصد ایزوله‏ها، در ایالات متحده آمریکا 9درصد ایزوله‌ها و در تایوان 6درصد آنها مقاوم به سیپروفلوکساسین بودند. در مقابل در ایزوله‏های کلبسیلا پنومونیه ایجادکننده باکتریمی در آفریقای جنوبی، استرالیا و بلژیک، هیچ مورد مقاومت به سیپروفلوکساسین مشاهده نشد (15). در مطالعه Al-Marzooq و همکاران (2014) در مالزی، 71درصد ایزوله‏های کلبسیلا پنومونیه، مقاوم به سیپروفلوکساسین گزارش شدند (16).

میزان مقاومت دارویی در بین ایزوله‏های شایع در کشور ایران از بسیاری از کشورها از جمله: آمریکا، استرالیا، تایوان، آفریقای جنوبی، بلژیک، آرژانتین بسیار بالاتر است؛ بنابراین استفاده از این آنتی‏بیوتیک باید با ملاحظات خاصی صورت گیرد. اما نسبت به کشورهای مالزی و ترکیه مقاومت به سیپروفلوکساسین در ایران کمتر است.

نتایج حاصل از مطالعه حاضر نشان داد که 7/11درصد از ایزوله‏ها به ایمی‏پنم مقاوم بودند که این میزان مقاومت برای دارویی که به‌عنوان آخرین خط درمانی برای عفونت‏های گرم منفی استفاده می‏شود، مقاومت به‌نسبت بالایی است. از سوی دیگر 6/3درصد ایزوله‏ها به داروی کلیستین مقاوم بودند که نشان از افزایش مقاومت به این آنتی‏بیوتیک دارد. Ah و همکاران در مطالعه خود، 5 سویه کلبسیلا پنومونیه مقاوم به کلیستین و کارباپنم را شرح دادند. در مطالعه آنها گفته شده است که افزایش استفاده از کلیستین برای درمان عفونت‏های ناشی از باکتری‏های گرم منفی مقاوم به چنددارو، منجر به ظهور مقاومت به کلیستین در کلبسیلا پنومونیه در سراسر جهان از جمله کشورهای اروپایی شده است و میزان آن در حال افزایش است (17).

ایزوله‌‏های کلبسیلا پنومونیه تولیدکننده کارباپنماز، به بسیاری از عوامل ضدّمیکروبی دیگر مورد استفاده در درمان باکتری‏های گرم منفی از جمله کینولون‏ها و آمینوگلیکوزیدها مقاوم هستند. در مطالعه حاضر، 8 ایزوله همزمان به آمینوگلیکوزید‏ها (جنتامایسین، آمیکاسین)، کینولون‏ها (سیپروفلوکساسین) و کارباپنم‏ها (ایمی‏پنم) مقاوم بودند. آنالیز نتایج مقاومت متقاطع نشان داد که 2/7درصد سویه‏های کلبسیلا پنومونیه مورد مطالعه، دارای مقاومت چنددارویی بودند و به 3 کلاس آنتی‏بیوتیکی بزرگ مورد بررسی یعنی سفالوسپورین‏ها، کارباپنم‏ها و کینولون‏ها پاسخ ندادند. 9درصد ایزوله‏ها (10 مورد) به هیچ‌یک از بتالاکتام‏های مورد بررسی پاسخ ندادند؛ همین‌طور 8سویه همزمان به جنتایسین، ایمی‏پنم، سیپروفلوکساسین و سفپیم مقاومت نشان دادند. همچنین نزدیک به 6درصد سویه‏ها به نسل چهارم سفالوسپورین‏ها مقاوم بودند.

در این مطالعه، نتایج انجام PCR بر روی ژن bla_CTX در ایزوله‏ها نشان داد که 3/70درصد آنها دارای این ژن بوده و 2/87درصد این سویه‏ها به ایمی‏پنم حساس بودند. همچنین نتایج نشان داد که در بین آمینوگلیکوزیدها، آمیکاسین در مقایسه با جنتامایسین پاسخ بهتری نشان داد؛ به‌طوری‌که 6/52درصد آنها به آمیکاسین حساس بودند. در مطالعه Wang و همکاران (2013) در کشور آمریکا بر روی کلبسیلا پنومونیه، در سال 2005 تا 2009 در حدود 7/1درصد ایزوله‏ها دارای ژن CTX بودند؛ در صورتی‌که در طی سال 2010 تا 2012 در حدود 4/26درصد ایزوله‏ها دارای این ژن بودند (18). در مطالعه Ahmed و همکاران (2013)، 3/53 درصد سویه‏های کلبسیلا پنومونیه دارای ژن CTX بودند (19). در مطالعه حاضر، درصد شیوع این ژن در ایزوله‏ها بالاتر بود که با نتایج دیسک‌دیفیوژن همخوانی دارد و هر دو روش فنوتیپی و ژنتیکی، نشان از بالاتربودن مقاومت در ایزوله‏های شایع در بیمارستان‏های کشور ما دارد.

در مطالعه حاضر، سویه‏های SDD، مقاومت بالایی به کینولون‏ها (سیپروفلوکساسین) نشان دادند؛ به‌طوری‌که 6سویه از 7سویه SDD به این دارو مقاوم بودند؛ در نتیجه از کینولون‏ها نباید به‌عنوان جایگزین برای درمان عفونت‏های ناشی از این سویه‏ها استفاده نمود. خوشبختانه تمام سویه‏های SDD به کارباپنم‏ها (ایمی‏پنم) حساس بودند؛ بنابراین ایمی‏پنم جایگزین مناسبی برای درمان بیماران مبتلا به بیماری‏های ایجادشونده توسط این سویه‏هاست. همچنین همه سویه‏های SDD به آنتی‏بیوتیک کلیستین حساسیت نشان دادند.

در گزارش مردانه و همکاران در سال 1394 در شیراز بر روی باکتری‏های جداشده از کشت خون بیماران، 5/21درصد موارد کشت مثبت متعلّق به خانواده انتروباکتریاسیه بودند. در بین اعضای این خانواده، 28درصد آنها کلبسیلا بودند که پس از اشریشیاکلی رتبه دوم را به خود اختصاص دادند. داروهای پلی‏میکسین B، کلستین و ایمی‏پنم مؤثّرترین داروها بر ضدّ سویه‏های ESBL مثبت کلبسیلا بودند (20). نتایج این گزارش با مطالعه ما همخوانی دارد و ایزوله‏های مطالعه حاضر نیز بهترین پاسخ را به این داروها نشان دادند. در بررسی‏های پورعباس و همکاران در سال 1394 در شیراز، از 175 باکتری گرم منفی جداشده از خون، 15درصد آنها گونه‏های کلبسیلا بودند. در مطالعه پورعباس، مؤثّرترین داروها بر روی ایزوله‏های کلبسیلا به‌ترتیب: ایمی‏پنم (98%) و لووفلوکساسین (80%) بودند که در مقایسه با ایزوله‏های مطالعه ما مقاومت بالاتری (3/88%) به ایمی‏پنم نشان دادند (3). این تفاوت می‏تواند در نتیجه دو عامل، اتفاق افتاده باشد: اول اینکه مطالعه ما جدیدتر بوده و سویه‏ها با گذشت زمان مقاوم‏تر شدند؛ دوم اینکه مطالعه ما بر روی انواع نمونه‏ها بوده و در نتیجه احتمال مشاهده مقاومت بالاتر بیشتر است.

از آنجایی‌که الگوی مقاومت دارویی در کشورهای مختلف و حتی در مناطق مختلف یک کشور متفاوت است و نیز این پروفایل مقاومت با گذشت زمان و افزایش استفاده از داروها، به‌طور مدام در حال تغییر است؛ بنابراین انجام بررسی‏های دوره‏ای و منظم الگوی مقاومت به‌منظور دست‏یابی به یک رژیم درمانی مناسب برای درمان بیماران ضرورت دارد (10، 21، 22). در بسیاری از موارد، بروز مقاومت در باکتری‏ها به‌دلیل استفاده داروها در صنایع مختلف از جمله صنایع دامداری و پروش ماکیان، به‌منظور کاهش عفونت‏ها و افزایش باروری و سوددهی، اتفاق می‏افتد. این ایزوله‏های مقاوم به دارو می‏توانند از طریق مواد غذایی و محصولات دیگر به جامعه انسانی و نیز محیط‏های بیمارستانی منتقل شوند و سبب بروز عفونت در افراد بستری در بیمارستان‏ها گردند (23-27).

نتیجه‌گیری

همه نتایج به‌دست‌آمده، نگران‌کننده و نشان‌دهنده افزایش رو به رشد مقاومت‏های چنددارویی در بین باکتری‏های بیماری‌زای بیمارستانی بودند. نتایج نشان از آن دارد که آنتی‏بیوتیک‏های بتالاکتام معمول، عملاً در درمان عفونت‏های بیش از 55درصد ایزو‏های کلبسیلا پنومونیه، مؤثّر نیستند و استفاده از آنها در درمان، علاوه بر بالا رفتن هزینه‏های درمانی سبب بروز هر چه بیشتر مقاومت می‌گردد؛ در نتیجه ضروری است که حتماً رژیم درمانی مورد استفاده توسط پزشکان بر اساس نتایج آنتی‏بیوگرام انجام‌شده توسط آزمایشگاه میکروب‏شناسی بالینی باشد.

منابع:

1- Paterson DL, Bonomo RA. Extended-spectrum beta-lactamases: a clinical update. Clin Microbiol Rev. 2005; 18(4): 657-86.

2- Adams-Sapper S, Nolen S, Donzelli GF, Lal M, Chen K, Justo da Silva LH, et al. Rapid induction of high-level carbapenem resistance in heteroresistant KPC-producing Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother. 2015; 59(6): 3281-9.

3- Poorabbas B, Mardaneh J, Rezaei Z, Kalani M, Pouladfar G, Alami MH, et al. Nosocomial Infections: Multicenter surveillance of antimicrobial resistance profile of Staphylococcus aureus and Gram negative rods isolated from blood and other sterile body fluids in Iran. Iran J Microbiol. 2015; 7(3): 127-35.

4- Deleo FR, Chen L, Porcella SF, Martens CA, Kobayashi SD, Porter AR, et al. Molecular dissection of the evolution of carbapenem-resistant multilocus sequence type 258 Klebsiella pneumoniae. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111(13): 4988-93.

5- Snitkin ES, Zelazny AM, Thomas PJ, Stock F; NISC Comparative Sequencing Program Group, Henderson DK, et al. Tracking a hospital outbreak of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae with whole-genome sequencing. Sci Transl Med. 2012; 4(148): 148ra116.

6- Vuotto C, Longo F, Balice MP, Donelli G, Varaldo PE. Antibiotic Resistance Related to Biofilm Formation in Klebsiella pneumoniae. Pathogens. 2014; 3(3): 743-58.

7- Reich F, Atanassova V, Klein G. Extended-spectrum β-lactamase- and AmpC-producing enterobacteria in healthy broiler chickens, Germany. Emerg Infect Dis. 2013; 19(8): 1253-9.

8- Traub WH, Schwarze I, Bauer D. Nosocomial outbreak of cross-infection due to multiple-antibiotic-resistant Klebsiella pneumoniae: Characterization of the strain and antibiotic susceptibility studies. Chemotherapy. 2000; 46(1): 1-14.

9- Arnold RS, Thom KA, Sharma S, Phillips M, Kristie Johnson J, Morgan DJ. Emergence of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing bacteria. South Med J. 2011; 104(1): 40-5.

10- Amin Shahidi M, Anvarinejad M, Abbasian A, Abbasi P, Rafaatpour N, Dehyadegari MA, et al. Characterization of nonfermenter bacteria resistant to multidrug ESBL producing isolated from patients blood samples using phenotypic methods in Shiraz (Iran). J Birjand Univ Med Sci. 2015; 22(3): 256-5. [Persian]

11- Shahid M, Malik A, Akram M, Agrawal LM, Khan AU, Agrawal M. Prevalent phenotypes and antibiotic resistance in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae at an Indian tertiary care hospital: plasmid-mediated cefoxitin resistance. Int J Infect Dis. 2008; 12(3): 256-64.

12- Bhullar K, Waglechner N, Pawlowski A, Koteva K, Banks ED, Johnston MD, et al. Antibiotic resistance is prevalent in an isolated cave microbiome. PLoS One. 2012; 7(4): e34953.

13- D'Costa VM, King CE, Kalan L, Morar M, Sung WW, Schwarz C, et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature 2011; 477(7365): 457-61.

14- Hernández J, Stedt J, Bonnedahl J, Molin Y, Drobni M, Calisto-Ulloa N, et al. Human-associated extended-spectrum β-lactamase in the Antarctic. Appl Environ Microbiol. 2012; 78(6): 2056-8.

15- Paterson DL, Mulazimoglu L, Casellas JM, Ko WC, Goossens H, Von Gottberg A, et al. Epidemiology of ciprofloxacin resistance and its relationship to extended-spectrum beta-lactamase production in Klebsiella pneumoniae isolates causing bacteremia. Clin Infect Dis. 2000; 30(3): 473-8.

16- Al-Marzooq F, Mohd Yusof MY, Tay ST. Molecular analysis of ciprofloxacin resistance mechanisms in Malaysian ESBL-producing Klebsiella pneumoniae isolates and development of mismatch amplification mutation assays (MAMA) for rapid detection of gyrA and parC mutations. Biomed Res Int. 2014; 2014: 601630.

17- Ah YM, Kim AJ, Lee JY. Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae. Int J Antimicrob Agents. 2014; 44(1):8-15.

18- Wang G, Huang T, Surendraiah PK, Wang K, Komal R, Zhuge J, et al. CTX-M β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae in suburban New York City, New York, USA. Emerg Infect Dis. 2013; 19(11): 1803-10.

19- Ahmed OI, El-Hady SA, Ahmed TM, Ahmed IZ. Detection of bla SHV and bla CTX-M genes in ESBL producing Klebsiella pneumoniae isolated from Egyptian patients with suspected nosocomial infections. Egypt J Med Hum Genet. 2013; 14(3): 277-83.

20- Mardaneh J, Anvarinejad M, Abbasian A, Abbasi P, Rafaatpour N, Dehyadegari M, et al. Emergence of Multi-drug Resistant ESBL Producing Strains among Enterobacteriaceae Members Isolated from Patients Blood Samples in South of Iran. Iranian South Medical Journal. 2015; 18(5): 970-81. [Persian]

21- Abbas Poor SH, Mardaneh J, Dehbashi S, Jasemi SS. Profile of antimicrobial susceptibility isolated microorganisms from hospitalized patients in PICU ward and detection of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus and ESBL-producing bacteria by phenotypic methods. Iranian South Medical Journal. 2014; 17 (4): 647-57. [Persian]

22- Jasemi SS, Alipoor F, Dehbashi S, Mardaneh J. Isolation of Citrobacter spp. from Blood Specimens in Patients Hospitalized in Kermanshah Imam Khomeini hospital and determination of the of isolates sensitivity to antibiotics: Short Communication. J Birjand Univ Med Sci. 2014; 21(3): 385-91. [Persian]

23- Mardaneh J, Soltan Dallal MM. Isolation and Identification Enterobacter asburiae from Consumed Powdered Infant Formula Milk (PIF) in the Neonatal Intensive Care Unit (NICU). Acta Med Iran. 2016; 54(1): 39-43.

24- Soltani J, Poorabbas B, Miri N, Mardaneh J. Health care associated infections, antibiotic resistance and clinical outcome: A surveillance study from Sanandaj, Iran. World J Clin Cases. 2016; 4(3): 63-70.

25- Mardaneh J, Soltan-Dallal MM. Isolation and Identification of E. cowanii from Powdered Infant Formula in NICU and Determination of Antimicrobial Susceptibility of Isolates. Iran J Pediatr. 2014; 24(3): 261-6.

26- Abbasi P, Kargar M, Doosti A, Mardaneh J, Ghorbani-Dalini S, Dehyadegari MA. Characterization of Shiga-toxin producing E.coli (STEC) and enteropathogenic E.coli (EPEC) using multiplex Real-Time PCR assays for stx1, stx2, eaeA. Iran J Microbiol. 2014; 6(3): 169-74.

27- Anvarinejad M, Pouladfar G, Japoni A, Bolandparvaz S, Satiary Z, Abbasi P, et al. Isolation and Antibiotic Susceptibility of the Microorganisms Isolated from Diabetic Foot Infections in Nemazee Hospital, Southern Iran. J Pathog. 2015; 2015: 328796.