Abstract Original Article
Maryam Ghorbani[1], Abbas Doosti[2]
Background and Aim: As one of the factors of gastric ulcers and cancer, Helicobacter pylori can live in the acidic environment of stomach for many years due to having urease enzyme. This enzyme requires Ni2+ and a group of auxiliary proteins such as ureE for its catalytic activity. Urease is not only a requisite factor to colonize the Helicobacter pylori but it is also pathogenic with different mechanisms. Regarding the high prevalence of these bacteria finding a way to prevent infection with them is necessary. The present research aimed at homogenizing . cloning of Helicobacter Pylori ureE gene into pIRES2-DS Red expression vector in order to create a DNA (gene) vaccine.
Materials and Methods: In this experimental study, the ureE gene fragment was amplified through PCR method and it was cloned using T/A cloning in the pTZ vector. Sub-cloning of the gene was done in pIRES2-DS Red vector using T4-ligase enzyme and it was transformed into E. coli TOP10F strain; and, then, amplified. The gene construct, which is a DNA vaccine candidate, was transferred to CHO cells using electroporation method to investigate the gene expression in eukaryotic systems. UreE gene expression was assessed in eukaryotic cells by means of SDS-PAGE.
Results: UreE gene cloning was confirmed in two vectors including pTZ as a replicative vector and pIRES2-DS Red expression vector by PCR, enzyme digestion, and sequencing methods. SDS-PAGE results confirmed the successful expression of the ureE gene in the eukaryotic system of CHO cells.
Conclusion: The recombinant pIRES2-DSRed-ureE construct is capable of successfully generating of polypeptides derived from Helicobacter Pylori ureE gene expression in bestial cells. Given that the protein product of the ureE gene is one of the most important proteins of the mentioned bacterium, . the created recombinant DNA in this research can be used as a DNA vaccine candidate against Helicobacter pylori in . future.
Key Words: Helicobacter pylori, ureE genes, Cloning, Electroporation
Journal of Birjand University of Medical Sciences. 2016; 23 (4): 286-297.
Received: October 4, 2016 Accepted: November 23, 2016
چکیده
زمینه و هدف: هلیکوباکتر پیلوری بهعنوان یکی از عوامل زخم معده و ایجادکننده سرطان معده قادر است با دارابودن آنزیم اورهآز، در محیط اسیدی معده سالها زندگی کند. این آنزیم بهمنظور فعالیت کاتالیتیکی خود، بهNi2+ و گروهی از پروتئینهای کمکی از جمله ureE نیازمند است. اورهآز نهتنها فاکتوری لازم برای کلنیزهشدن هلیکوباکتر پیلوری است، بلکه با مکانیزمهای مختلفی باعث بیماریزایی میشود. با توجه به شیوع بالای این باکتری، یافتن راهی برای پیشگیری از وقوع عفونت ضروری به نظر میرسد. هدف از این مطالعه، همسانهسازی ژن ureE هلیکوباکتر پیلوری در ناقل بیانی pIRES2-DSRed بهمنظور ایجاد واکسن ژنی بود.
روش تحقیق: در این مطالعه تجربی، ابتدا قطعه ژن ureE به روش PCR تکثیر گردید و با کلونسازی T/A درون وکتور pTZ کلون شد. سابکلونینگ این ژن در وکتور pIRES2-DSRed با استفاده از آنزیم T4-لیگاز انجام شد و در باکتری E. coli سویه Tpo10F ترانسفرم و تکثیر شد. سازواره حاصل که کاندیدای واکسن ژنی است، برای بررسی بیان ژن در سیستم یوکاریوتی، به روش الکتروپوریشن به سلولهای CHO منتقل گردید. بررسی بیان ژن ureE در سلولهای جانوری با SDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت.
یافتهها: همسانهسازی ژن ureE در دو وکتور تکثیری pTZ و بیانی pIRES2-DSRed، با روشهای PCR، هضم آنزیمی و تعیین توالی تأیید شد. نتایج SDS-PAGE مؤیّد بیان موفقیتآمیز ژن ureE در سیستم یوکاریوتی سلولهای CHO بود.
نتیجهگیری: سازواره ژنی نوترکیب pIRES2-DSRed-ureE قادر به تولید موفق پلیپپتید حاصل از بیان ژن ureE هلیکوباکتر پیلوری در سلولهای جانوی میباشد. با توجه به اینکه محصول پروتئینی ژن ureE یکی از پروتئینهای مهم باکتری مذکور است، بنابراین میتوان از سازواره ایجادشده در این مطالعه، بهعنوان کاندیدای واکسن ژنی بر ضدّ هلیکوباکتر پیلوری در آینده استفاده کرد.
واژههای کلیدی: هلیکوباکتر پیلوری، ژن ureE، همسانهسازی، الکتروپوریشن
مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی بیرجند. 1395؛ 23 (4): 286-297.
دریافت: 13/07/1395 پذیرش: 03/09/1395
مقدمه
هلیکوباکتر پیلوری، باکتری گرم منفی، میکروآئروفیل[5] از خانواده کامپیلوباکتریاسه[6] با طول 4-2 میکرومتر و عرض 5-1 میکرومتر و معمولاً به شکل اسپریل است؛ ولی گاه به شکل میلهای هم دیده میشود. این باکتری وقتی در محیط کشت بهمدت طولانی نگهداری شود، شکل کوکسی پیدا میکند. هلیکوباکتر پیلوری دارای چندین تاژک در یک قطب بوده و نوک تاژکها دکمهمانند است (۱). این باکتری اولینبار توسط Warrenو Marshal در سال 1982 کشف گردید (۲).
هلیکوباکتر پیلوری دارای طیف محدودی از میزبانهاست که تقریباً منحصر به انسان و برخی از پریماتهاست. عفونت حاصل از این باکتری میتواند بهطور مستقیم از انسان به انسان، از طریق دهانی-دهانی یا مدفوعی-دهانی انتقال پیدا کند (۱). عفونت ایجادشده توسط هلیکوباکتر پیلوری که با تخریب بافت اپیتلیال معده همراه است، منجر به التهاب مزمن معده میشود که میتواند سبب ایجاد زخمهای معده و دوازده شود. عفونت مزمن هلیکوباکتر پیلوری با سرطان بدخیم معده مرتبط است. این باکتری همچنین عامل ایجاد بیماریهای معدهای نظیر گاستریت حاد فعال، بیماری زخم معده، آتروفی مخاط معده و آدنوکارسینوم معده میباشد (۳، ۴).
برجستهترین خصوصیت بیوشیمیایی این باکتری، تولید مقدار فراوان آنزیم اورهآز است (۵). ژن اورهآز، اولینبار در کلبسیلا کشف شد. اورهآز یک آنزیم دارای نیکل است که بهعنوان فاکتور بیماریزایی در انواع پاتوژنهای انسانی عمل میکند و در متابولیسم منابع گوناگون نیتروژن در میکروارگانیسمها و گیاهان مشارکت میکند (6، 7). تغییرات پس از ترجمه روی آنزیم اورهآز شامل کربوکسیلاسیونلیزین 219 و قراردادن دو یون نیکل در جایگاه فعال آن است (۸).
برای فعالیت اورهآز، سه پروتئین اورهآز کمکی به نام UreD، UreF و UreG لازم است و پروتئین کمکی چهارمی بهنام UreEبه تسهیل این فرآیند کمک میکند. Apo اورهآز،UreD ، UreFو UreG کمپلکسی میسازند که دیاکسیدکربن و نیکل را با هیدرولیز GTP به UreG میدهد؛ سپس نیکل به UreEمنتقل میشود (۹). پروتئین UerE در کلبسیلا آئروژنز، در جمعآوری متالوسنتر اورهآز نقش دارد (۱۰). این پروتئین اگرچه مانند یک پروتئین محلول رفتار میکند، پیشبینیشده دارای رشتههای بتاآمفیپاتیک[7] است و بسیار محکم به رزینفنیلسفارز باند میشود. UreE[8] یک پروتئین سیتوپلاسمی است و هر مولکول دایمر آن طبق اندازهگیریهای دیالیز تعادلی به 25/0±05/6 یون نیکل متصل میشود. جایگاه نیکل بهشکل هندسی هشتوجهی، با سه تا پنج لیگاند ایمیدازول هیستیدین اشغال میشود و بقیه لیگاندها، دهندگان نیتروژن و اکسیژن هستند (۱۱). سلولهایی که در ژن ureE آنها، حذف اتفاق افتاده است، فعالیت اورهآزشان کم شده و همزمان محتوای نیکل آنها نیز کم میشود. UreE پروتئینی است که به نیکل متصل میشود و بهعنوان دهنده نیکل به آپوپروتئین اورهآز عمل میکند. بررسی توالی ژن ترجمهشده، جایگاههای اتصال به فلز را نشان میدهد؛ از جمله انتهای کربوکسیل جایی که 10 تا 15 باقیمانده هیستیدین وجود دارد (۱۱).
برای درمان عفونت ناشی از هلیکوباکتر پیلوری، از رژیمهای درمانی سهگانه (دو آنتیبیوتیک و یک مهارکننده پمپ پروتونی یا ترکیبات بیسموتی[9]) بهمدت یک هفته استفاده میشود (۱۲). بازگشت دوباره این آلودگی بهدلیل ایجاد مقاومت، درمان ثانویه و نهایی آن را دچار مشکل میکند و این امر هزینههای اقتصادی زیادی برای کشورها در پی دارد (۱۳). اطلاع از نوع پاسخ ایمنی مؤثّر در حفاظت بر ضدّ باکتری و شناسایی آنتیژنهای مناسب باکتری در تحریک ایمنی و پاسخ ایمنی ناشی از آنها، از نکات اصلی در راستای دستیابی به واکسنهای کارآمد بهشمار میآید. برای تولید یک واکسن مؤثر بر هلیکوباکتر پیلوری، آنتیژن پایدار، حفاظتشده و قوی ضروری است. در این زمینه آنتیژنهای مختلف مانند اورهآز بررسی شدهاند (۱۴).
بر اساس مقالات موجود، اورهآز باکتری بهخاطر ارتباط با سطح هلیکوباکتر پیلوری و فراوانی توسط گروههای مختلف، یکی از بهترین کاندیداهای واکسن میباشد. ژن اورهآز برای حیات باکتری مهم است و اورهآز یک متالوآنزیم ضروری برای بقای باکتری در محیط اسیدی معده میباشد (۱۴). مجموعه ژنی مسئول رمزگذاری و پردازش آنزیم اورهآز در کروموزوم هلیکوباکتر پیلوری، مشتمل بر چندین قطعه ژنی دنبال هم است که بهترتیب بهصورت: ureA، ureB، ureI، ureE، ureF، ureG و ureH در کنار هم قرار گرفتهاند (15). در تحقیقات گذشته، بخشهای مختلف این مجموعه ژنی بهعنوان واکسن ژنی یا واکسن پپتیدی مورد ارزیابی قرار گرفته است. در مطالعهای که کریمی و محمدی با هدف ایجاد واکسن نوترکیب در سال 2001 انجام دادند، زیرواحدهای ureA و ureB در وکتور pET کلون و در باکتری E. coli سویه BL21-DE3 بیان گردیدند (16). در مطالعات متعدد دیگر، فعالیت تحریک سیستم ایمنی و واکنش سرمی برخی از اجزای این مجموعه ژنی، به اثبات رسیده است. در مطالعهای که در سال 2014 در مالزی به انجام رسید، ضمن کلونسازی و بیان ureG، خاصیت واکنشدهی آن با سرم خون انسانهای مبتلا به هلیکوباکتر پیلوری نشان داده شد؛ در صورتی که در نمونههای کنترل (افراد سالم)، چنین واکنشی دیده نشد (17). در سال 2013، مطالعه انجامشده در مورد یک واکسن ژنی بر اساس ureI، مؤیّد تحریک بسیار بالای سیستم ایمنی سلولی و هومورال بود (18). هر چند در مورد ureE مطالعات زیادی صورت نگرفته، اما مطالعات نشان داده است که محصول پروتئینی ureE، یک مولکول آنتیژنی کموزن است و UreH نیز بهعنوان جزئی از پروتئینهای کمکی اورهآز، از خاصیت آنتیژنی برخوردار است (19).
مطابق با آنچه گفته شد، بیشتر اجزای مجموعه ژنی اورهآز هلیکوباکتر پیلوری برای تحریک سیستم ایمنی میزبان بر ضدّ هلیکوباکتر پیلوری مناسب هستند؛ اما در زمینه ureE مطالعات زیادی انجام نشده است. بنابراین هدف از مطالعه حاضر جداسازی، تکثیر، کلونسازی و بررسی بیان اولیه ژن ureE هلیکوباکتر پیلوری در سیستم یوکاریوتی بد تا بتوان از آن بهعنوان کاندیدای واکسن ژنی بر ضدّ این باکتری یاد کرد.
روش تحقیق
این مطالعه، یک مطالعه تجربی میباشد.
سویههای باکتریایی، وکتورها و سلول جانوری:
در این مطالعه، باکتری هلیکوباکتر پیلوری، سویه استاندارد ATCC 43504 از بخش میکروبیولوژی انستیتوپاستور ایران تهیه شد. از این هلیکوباکتر بهمنظور استخراج DNA و تکثیر و جداسازی ژن ureE استفاده شد.
باکتری اشرشیاکلای سویه Top10F که برای اهداف کلونسازی ژن و تکثیر پلاسمیدهای نوترکیب استفاده میشود، از مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، تهیه شد. برای کلونسازی قطعات تکثیرشده ژن ureE (محصولات PCR)، از روش همسانهسازی T/A و وکتور T ساخت شرکت ترموفیشر آمریکا بهنام pTZ57R/T (بهصورت مخفف pTZ) بهره گرفته شد. اندازه این وکتور بدون درج ژن جدید در آن، 2886 جفت باز میباشد و نشانگر انتخابی آن برای باکتریهای ترانسفرمشده، مقاومت نسبت به آنتیبیوتیک آمپیسیلین است. وکتور بیانی مورد استفاده در این پژوهش، به نام pIRES2-DSRed و ساخت شرکت کلونتک آمریکا بود. اندازه این وکتور 5264 جفت باز است و نشانگرهای انتخابی این وکتور برای انتخاب سلولهای باکتریایی و سلولهای جانوری ترانسفرمشده، بهترتیب: کانامایسین و نئومایسین است و دارای پروموتر معروف CMV برای بیان ژن کلونشده میباشد. سلول جانوری رده تخمدان همستر چینی (Chinese Hamster Ovary or CHO) که بهمنظور بررسی بیان ژن ureE در سیستم یوکاریوتی بهکار گرفته شد، از مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد تهیه شد.
استخراج DNA و تکثیر ژن ureE:
بهمنظور استخراج DNA ژنومی از باکتری هلیکوباکتر پیلوری، از کیت استخراج DNA ساخت شرکت سیناژن ایران استفاده شد؛ سپس توالی پرایمرها برای تکثیر ژن ureE با استفاده از نرمافزار Generunner طراحی شد که پرایمر رفت 5'-TACCTCGAGTCCAACACTGGGTGTGAGATG-3' دارای سایت برش برای آنزیم محدودالاثر XhoI و پرایمر برگشت 5'-TACGAGCTCATTTCTTTTCTATTTTACGACCAC-3' نیز دارای سایت برشی برای آنزیم محدودالاثر SacI در سر 5-پریم بودند. زیرتوالی سایت برش هر یک از آنزیمهای مذکور، خط کشیده شد. این سایتهای برش، بهمنظور سهولت سابکلونینگ و نقل و انتقال ژن بین وکتورها در نظر گرفته شدند. ملاک انتخاب این دو سایت برش آنزیمی، بر اساس جهت و نوع توالیهای برشی موجود در وکتور بیانی pIRES2-DSRed بود؛ ضمن اینکه هیچیک از آنزیمهای XhoI و SacI نباید بر توالیهای داخلی ژن ureE اثر داشته باشند.
واکنشPCR در حجم نهایی ۲۵ میکرولیتر انجام شد؛ بهطوری که ابتدا مسترمیکس در حجم نهایی 1000میکرولیتر، شامل 100میکرولیتر از بافر PCR با غلظت 10x، 40 میکرولیتر MgCl2 با غلظت 50 میلیمولار و 20میکرولیتر dNTP با غلظت 10میلیمولار با افزودن 840میکرولیتر آب تزریق، تهیه شد. سپس بهازای هر یک میکروتیوپ واکنشگر، مقدار 20میکرولیتر از مسترمیکس با 100نانومول از هر یک از پرایمرهای رفت و برگشت، 100نانوگرم DNAی ژنومی هلیکوباکتر پیلوری و یکواحد آنزیم SmarTaq DNA polymerase (شرکت سیناژن، ایران) مخلوط شد. در پایان، برای جلوگیری از آلودگی و تبخیر، یک قطره روغن معدنی استریل روی واکنشگرها اضافه شد. مخلوط حاصل با شرایط دمایی ۵ دقیقه واسرشتشدن ابتدایی در دمای ۹۵درجه سانتیگراد و در ادامه ۳۰ چرخه شامل واسرشتشدن در دمای ۹۴ درجه سانتیگراد بهمدّت ۱ دقیقه، اتصال در دمای ۶۲ درجه سانتیگراد بهمدّت ۱ دقیقه، طویلشدن در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد بهمدّت ۱دقیقه و در نهایت طویلشدن نهایی در دمای ۷۲درجه سانتیگراد بهمدت ۵ دقیقه، طویلشدن در دمای ۷۲درجه سانتیگراد بهمدت ۱ دقیقه و در نهایت طویلشدن نهایی در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد بهمدت ۵دقیقه داخل دستگاه ترموسایکلر حرارتی (ساخت شرکت اپندرف، آلمان) انجام شد.
بهمنظور تأیید وجود قطعات ژنی حاصل از تکثیر ژن ureE، محصولات PCR روی ژل آگارز یکدرصد در حضور نشانگر 100 جفت بازی با ولتاژ متوسط 90ولت بهمدت 30دقیقه الکتروفورز گردید. سپس قطعه DNA مربوط به ژن ureE در حضور نور ماورای بنفش و با استفاده از تیغ اسکالپل بریده شد و به میکروتیوپ استریل 5/1 میلیلیتری منتقل گردید و با استفاده از کیت استخراج DNA از ژل (ساخت شرکت Bionner کشور کره جنوبی) تخلیص گردید. برای تأیید ژن تخلیصشده از ژل، 3میکرولیتر از محلول بهدستآمده روی ژل آگارز یکدرصد الکتروفورز شد.
کلونسازی T/A:
کلونسازی بهروش T/A، تکنیکی است که مخصوص کلونسازی محصولات PCR است. در این تکنیک، از وکتورهای تجاری تحت عنوان T-Vector بهره گرفته میشود. T-Vector در واقع در ابتدای امر یک وکتور خطی است که در دو سر خود دارای نوکلئوتید T بهصورت تکرشتهای میباشد و پس از درج محصول PCR در آن، بهصورت حلقوی در میآید. از طرف دیگر بسیاری از آنزیمهای پلیمرازی نظیر آنزیم DNA پلیمراز Taq، هنگام تکثیر قطعات ژنی، در دو انتهای محصولات یک نوکلئوتید A بهصورت تکرشته و بدون الگو اضافه مینمایند. چون T با A مکمل است و جفت میشوند؛ بنابراین محصولات PCR بهآسانی در وکتورهای T، درج میگردند. به این روش، تکنیک کلونسازی T/A گویند.
همانطور که در بخش معرفی وکتورها در بالا اشاره شد، وکتور pTZ بهمنظور کلونسازی T/A مورد استفاده قرار گرفت و مراحل الحاق ژن به وکتور موردنظر مطابق دستور کار کیت مربوطه انجام شد. وکتورهای pTZ نوترکیب حامل ژن ureE هلیکوباکتر پیلوری، بهروش شیمیایی و با استفاده از کلرید کلسیم 1/0 مولار سرد استریل و سپس شوک حرارتی به سلولهای E. coli سویه TOP10F منتقل گردیدند. باکتریهای ترانسفرمشده، روی پلیت لوریا برتانی آگار حاوی 50میکروگرم در میلیلیتر آمپیسیلین کشت داده شدند. از کلنیهای حاصل با استفاده از کیت استخراج پلاسمید (ساخت شرکت Bionner کشور کره جنوبی)، تخلیص پلاسمید انجام شد و تأیید صحت همسانهسازی T/A به دو روش PCR و هضم آنزیمی انجام شد. PCR روش اولیه تأیید صحت کلونینگ بود و با انجام هضم آنزیمی، کلونشدن ژن موردنظر در پلاسمید بهصورت نهایی تأیید شد. برای انجام هضم آنزیمی، از آنزیمهای محدودالاثر SacI وXhoI استفاده شد.
کلونسازی ژن در وکتور بیانی (سابکلونینگ):
سابکلونینگ بهمعنی وارد کردن یک ژن از وکتوری به وکتور دیگر میباشد. با توجه به اینکه وکتور pIRES2-DSRed بهعنوان وکتور بیانی یوکاریوتی در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفت، بنابراین باید ژن ureE بهروش مناسبی در آن درج گردد. به این منظور، ابتدا وکتور نوترکیب pTZ-ureE توسط دو آنزیمSacI وXhoI برش داده شد تا ژن ureE از آن خارج گردد. سپس وکتور pIRES2-DSRed نیز با همین آنزیمها بریده شد تا سرهای مناسب برای پذیرش ژن ureE در آن ایجاد گردد. همه محصولات هضم آنزیمی روی ژل آگارز 1درصد الکتروفورز شده و قطعه ژن ureE و وکتور pIRES2-DSRed از روی ژل با استفاده از تیغ اسکالپل بریده و جدا شدند. تخلیص DNA از ژل با کمک کیت (Bioneer کشور کره جنوبی) انجام شد. واکنش اتصال (Ligation) بین وکتور بیانی و ژن ureE، با استفاده از آنزیم T4-لیگاز (ساخت شرکت سیناژن ایران) انجام شد. محصولات اتصال بهروش شیمیایی با بهکاربردن کلرید کلسیم 1/0 مولار استریل، وارد باکتری E. coli سویه TOP10F شدند و مراحل شوک حرارتی و کشت روی محیط لوریا برتانی آگار دارای آنتیبیوتیک انتخابی (50 میکروگرم در هر میلیلیتر از کانامایسین) و بهدنبال آن گرمخانهگذاری بهمدت یک شب در دمای 37 درجه سانتیگراد انجام شد. تأیید صحت کلونینگ، روی کلنیهای بهدستآمده از این مرحله انجام شد. برای تأیید صحت کلونینگ بهترتیب سه روش PCR، هضم آنزیمی با آنزیمهایSacI وXhoI (ساخت شرکت ترمو فیشر آمریکا) و در نهایت تعیین توالی بهکار برده شد.
انتقال سازواره نهاییpIRES2-DSRed-ureE به سلولهای جانوری:
در این مطالعه بهمنظور بررسی بیان ژن ureEدر سلولهای یوکاریوتی، از سلول CHO استفاده شد و برای دگرگونی این سلولها، روش الکتروپوریشن بهکار گرفته شد. سلولها در محیط کشتRPMI 1640 (ساخت شرکت مرک آلمان) حاوی 10درصد FBS (ساخت شرکت مرک آلمان) و 100میکروگرم در هر میلیلیتر پنیسیلین و استرپتومایسین (بهمنظور جلوگیری از آلودگی باکتریایی) و در دمای 37درجه سانتیگراد و در حضور 5درصد گازکربنیک کشت داده شدند. برای انجام انتقال ژن به این سلولها، روش الکتروپوریشن با استفاده از دستگاهGene Pulser Xcell (ساخت شرکت Bio-Rad آمریکا) مورد استفاده قرار گرفت. تعداد 106×2 عدد از سلولهایCHO شمارش و در حجم 400 میکرولیتر در کووت 4/0 استریل مخصوص الکتروپوریشن ریخته شد. سپس مقدار 800 نانوگرم در هر میکرولیتر از ژن مورد نظر برای انتقال (وکتور نوترکیب pIRES2-DSRed-ureE) به سولهای CHO اضافه شد و به آرامی مخلوط گرید. این سوسپانسیون سلولی بهمدّت 10دقیقه روی یخ قرار داده شد. پس از انتقال کوت حاوی سلولها به درون دستگاه الکتروپوریشن، پالسالکتریکی با شرایط بهینهسازی شده 174/0 کیلوولت و 400 میکروفاراد به سلولها داده شد و سلولها بلافاصله بهمدّت 2 دقیقه روی یخ قرار داده شدند. سپس سلولهای ترانسفرمشده در فلاسک حاوی محیط کشت RPMI بههمراه 10درصد FBS و آنتیبیوتیکهای پنیسیلین و استرپتومایسین کشت داده شدند و بهمدت 5ساعت در انکوباتور با دمای 37درجه سانتیگراد و 5درصد CO2 قرار داده شدند. سپس به هر یک از فلاسکهای کشت، آنتیبیوتیک نئومایسین بهعنوان نشانگر انتخابی سلولهای دریافتکننده وکتور نوترکیب بهمقدار 100میکروگرم در هر میلیلیتر اضافه شد. درنهایت سلولها بهمدت 3 روز دیگر در انکوباتور نگهداری شدند. تمام مراحل فوق (الکتروپوریشن) همچنین برای سری دیگری از سلولهای CHO که بهعنوان شاهد در نظر گرفته شده بودند، انجام شد؛ با این تفاوت که به سلولهای گروه شاهد، بهجای DNA، مقدار 2 میکرولیتر PBS استریل اضافه شد.
انجام SDS-PAGE:
بررسی بیان ژن ureE کلونشده در وکتور pIRES2-DSRed، به روش SDS-PAGE صورت گرفت. این روش شامل الکتروفورز نمونههای پروتئین (ولتاژ 200 ولت بهمدّت 3 ساعت صورت)، رنگآمیزی ژل با کوماسی بلو و رنگبری توسط محلول رنگبر است. به این منظور، سلولهای CHO بهروش ذوب و انجماد متناوب (freeze and thow) تخریب شدند و عصاره سلولی بهدستآمده با استفاده از سرنگ هامیلتون به چاهکهای روی ژل عمودی وارد گردید. همچنین در یکی از چاهکها مقدار 5میکرولیتر نشانگر پروتئینی ریخته شد و الکتروفورز انجام شد؛ سپس رنگآمیزی ژل با کوماسیبلو انجام گرفت.
یافتهها
تکثیر و جداسازی ژن ureE هلیکوباکتر پیلوری:
DNA از باکتری هلیکوباکترپیلوری با موفقیت استخراج شد. الکتروفورز DNA تخلیصشده روی ژل آگارز یکدرصد، نشاندهنده کیفیت مناسب DNA برای انجام PCR بود. انجام واکنش PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن ureE، باند ۵۵۲ جفت بازی مربوط به محصول را تشکیل داد؛ سپس محصولات PCR روی ژل یکدرصد الکتروفورز گردیدند (شکل ۱).