Abstract Original Article
Gholamreza Pourali Sheshblouki[1],[2], Jalal Mardaneh[3]*
Background and Aim: Klebsiella pneumoniae is a member of the Enterobacteriaceae family. There is a global emergence of multidrug-resistant (MDR) strains of K. pneumoniae, a Gram-negative enteric bacterium that causes nosocomial and urinary tract infections. The aims of the present study were to identify the Klebsiella pneumoniae infections in hospitalized patients, characterization of blaCTX gene, detection cross-resistance and cefepime susceptible-dose dependent (SDD) in isolates.
Materials and Methods: In present study, 111 strains of Klebsiella pneumoniae were isolated from patients hospitalized in Ghotbadden, Faghihi and Nemazee hospitals (Shiraz, Iran). The isolates were identified as K.pneumoniae, based on biochemical tests embedded in the API-20E system. Susceptibility testing (disc diffusion) was performed according clinical and laboratory standards institute (CLSI) guidelines. Detection cefepime susceptible-dose dependent (SDD) was performed. The detection of AmpC β-lactamases producing strains was done based on cefoxitin and cefepime disk tests. The blaCTX gene was detected in the isolates by PCR molecular method.
Results: Total 111 Klebsiella pneumoniae isolates were studied. The less effective drug was ceftazidime (37.8% isolates were sensitive). All SDD strains were susceptible to colistin and imipenem. Colistin (96.4%) and imipenem (88.3%) were the most effective antibiotics against isolates. Respectively, 41.4% and 35.1% isolates displayed resistance to gentamicin and amikacin. All colistin resistant isolates were imipenem sensitive. The results of PCR on blaCTX gene showed that 70.3% of the isolates possess the gene.
Conclusion: Carbapenem drugs are effective against Klebsieella pneumoniae infections. These results indicate that multidrug-resistant (MDR) and extensively drug resistant (XDR) strains of K.pneumoniae are rising, and fewer antibiotics may be useful for treating infections caused by these strains. Routine investigation and reporting of antibiotics resistance profile in patients presenting with Klebsiella infections is suggested.
Key Words: Hospitalized patients, Blood, Bacterial infection, Klebsiella pneumoniae, Antibiotic resistance pattern, Susceptible-dose dependent.
Journal of Birjand University of Medical Sciences. 2016; 23 (1): 56-66.
Received: June 17, 2015 Accepted: February 23, 2016
غلامرضا پورعلی شش بلوکی[4]،[5]، جلال مردانه[6]
چکیده
زمینه و هدف: کلبسیلا پنومونیه یکی از اعضای خانواده انتروباکتریاسیه است که سبب عفونتهای بیمارستانی میشود. در حال حاضر، با ظهور سویههای مقاوم به چنددارو (MDR) این باکتری در جهان، روبرو هستیم. هدف از مطالعه حاضر جداسازی کلبسیلا پنومونیه از بیماران بستری در بیمارستان، شناسایی ایزولههای دارای ژن blaCTX، تعیین Cross-resistance و شناسایی ایزولههای حساس وابسته به دوز (Susceptible-dose dependent (SDD)) نسبت به سفپیم بود.
روش تحقیق: در این مطالعه مقطعی، 111 سویه کلبسیلا پنومونیه از بیماران بستری در بیمارستانهای قطبالدین، فقیهی و نمازی شیراز (ایران) جداسازی شدند. ایزولهها بر اساس تستهای بیوشیمیایی موجود در سیستم API20E بهعنوان کلبسیلا پنومونیه شناخته شدند. تست حساسیت آنتیبیوتیکی با استفاده از روش دیسکدیفیوژن و پروتکل سازمان استانداردهای بالینی و آزمایشگاهی (CLSI 2014) انجام شد. ایزولههای حساس وابسته به دوز نسبت به سفپیم شناسایی شدند. شناسایی سویههای تولیدکننده AmpC β-lactamase با استفاده از دیسکهای سفوکسیتین و سفپیم انجام گرفت. از روش ملکولی PCR برای شناسایی سویههای دارای ژن blaCTX استفاده شد.
یافتهها: بهطور کلی 111 ایزوله کلبسیلا پنومونیه، مورد مطالعه قرار گرفتند. کماثرترین دارو سفتازیدیم (8/37 درصد ایزولهها حساس بودند) بود. همه سویههای SDD حساس به ایمیپنم و کلیستین بودند. کلیستین (4/96%) و ایمیپنم (3/88%) مؤثّرترین آنتیبیوتیکها بر ضدّ ایزولهها بودند. میزان مقاومت به جنتامایسین 4/41 درصد بود. نتایج انجام PCR بهمنظور جستجوی ژن blaCTX در ایزولههای کلبسیلا پنومونیه نشان داد که 3/70 درصد سویهها دارای این ژن بودند.
نتیجهگیری: این نتایج نشان داد که سویههای کلبسیلا پنومونیه مقاوم به چنددارو (MDR) و مقاوم به طیف وسیعی از داروها (XDR) در حال افزایش است و کمتر آنتیبیوتیکی ممکن است برای درمان عفونتهای ناشی از این سویهها مفید باشد.
واژههای کلیدی: بیماران بستری در بیمارستان، خون، عفونت باکتریای، کلبسیلا پنومونیه، الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی، حساس وابسته به دوز
مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی بیرجند. 1395؛ دوره 23 (1): 56-66.
دریافت: 2703/1394 پذیرش: 04/12/1394
مقدمه
کلبسیلا پنومونیه؛ باسیلی گرم منفی، دارای کپسول، غیر متحرّک و فاقد اسپور است که در خانواده باکتریایی انتروباکتریاسیه قرار دارد. این باکتری، یک پاتوژن فرصتطلب محسوب شده و به کلاسهای مختلف آنتیبیوتیکی بهکمک روشهای مختلف، مقاومت نشان میدهد (1).
عفونتهای ناشی از ایزولههای کلبسیلا پنومونیه- تولیدکننده آنزیمهای غیرفعالکننده آنتیبیوتیکهای کارباپنم یعنی کارباپنمازها- در حال گسترش در سراسر جهان بوده و سبب افزایش مرگ و میر در مبتلایان میگردد. مکانیسم مقاومت به کارباپنمها بسیار حائز اهمیت هستند؛ زیرا اغلب بهوسیله تستهای غربالگری روتین قابل شناسایی نیستند و پتانسیل بالقوّهای برای گسترش دارند. بهدلیل محدود بودن انتخابهای درمانی، علاوه بر چالشهای کنترل عفونت که در حال افزایش هستند، عفونتهای ناشی از این ارگانیسم، پزشکان را با چالشهای جدّی در درمان روبرو کرده است (1). انتروباکتریاسیهها در بین عوامل ایجادکننده عفونتهای بیمارستانی هستند. شناسایی سریع باکتریهای تولیدکننده KPC بهوسیله روشهای آزمایشگاهی بهمنظور دستیابی به کنترل عفونت، بسیار حائز اهمیت است (2).
کلبسیلا پنومونیه از جمله میکروارگانیسمهای مسئول بسیاری از عفونتهای حاد از جمله عفونتهای گردش خون در بیماران بستری در بیمارستان است. ظهور سویههای با مقاومت به بسیاری از آنتیبیوتیکهای وسیعالطیف شامل کارباپنمها، یک مشکل جدّی در بیماران دارای بیماری شدید است (2، 3). مقاومت دارویی یک مشکل عمده در درمان بیماران مبتلا به بیماریهای عفونی در تمام جهان است. انتروباکتریاسیههای مقاوم به کارباپنم بهویژه کلبسیلا پنومونیه، بهعنوان یک عامل مهم بروز عوارض و مرگ و میر در بین عفونتهای اکتسابی از بیمارستان و عفونتهای طولانیمدت مرتبط با مراقبتهای بهداشتی مطرح است. بهطور قابل توجهی مرگ و میر بسیار بالایی (30 تا 70 درصد) در بین بیماران مبتلا به باکتریمی یا عفونتهای تنفسی ناشی از کلبسیلا پنومونیه تولیدکننده کارباپنمازها وجود دارد (4، 5).
در سال 2013، شیوع عفونتهای بالینی کلبسیلا پنومونیه تخمین زده شده در ایالات متحده در بیمارستانهای با مراقبتهای طولانیمدت در مقایسه با واحدهای مراقبت ویژه بیمارستانی کوتاهمدت، بالاتر بود (6). اگر چه کلبسیلا پنومونیه دارای میزان متوسطی از پنیسیلینازهای کروموزمی است، این ارگانیسم بهخوبی بهعنوان یک جمعکننده پلاسمیدهای مقاومت چنددارویی است (7). کسب پلاسمیدهای مقاومت و وقوع موتاسیونهای کروموزومی که سبب بروز مقاومت به فلوروکینولونها میشود، سبب میشود که اغلب درمان عفونت ناشی از کلبسیلا پنومونیه مرتبط با عفونتهای مراقبتهای بهداشتی، فقط بهوسیله استفاده از کارباپنمها بهعنوان آخرین خط درمانی آنتیبیوتیکی انجام شود (8). معمولاً کمتر آنتیبیوتیکی بر روی کلبسیلا پنومونیه تولیدکننده آنزیم KPC مؤثّر است و عفونت با این سوش، با مرگ و میر بالایی در بین بیماران مبتلا به عفونتهای گردش خون مرتبط است. در حقیقت بسیاری از این سویهها به کلیستین، تیگسیکلین و حداقل یکی از آمینوگلیکوزیدها حساس هستند؛ اما برخی از آنها حتی به این داروها نیز مقاوم هستند (6).
عفونتهای ناشی از کلبسیلا پنومونیه تولیدکننده کارباپنماز، همراه با افزایش هزینههای درمانی و بستریشدن طولانیمدت در بیمارستان و شکست درمانی و مرگ و میر همراه خواهد بود. پیشآگهی ضعیفی از عفونتهای ناشی از باکتریهای گرم منفی تولیدکننده کارباپنماز گزارش شده است. در گزارشی از ایالات متحده آمریکا که بر روی عفونتهای گردش خون ناشی از باکتریهای تولیدکننده کارباپنماز در سال 2011 انجام شد، میزان مرگ و میر بیماران 47 تا 66 درصد بود (9). در بررسی دیگری نشان داده شد که خطر مرگ در بیماران مبتلا به عفونتهای ناشی از این سویهها 2 برابر افزایش داشت (9).
با توجه به استفاده گسترده از آنتیبیوتیکها در ایران و افزایش خطر مقاومت دارویی و نیز با توجه به اینکه در ایران کمتر مطالعهای بر روی باکتری کلبسیلا اکسیتوکا انجام شده است، اهداف این مطالعه شامل: تعیین پروفایل مقاومت آنتیبیوتیکی در ایزولههای بالینی کلبسیلا اکسیتوکا، شناسایی ایزولههای حساس وابسته به دوز[7] نسبت به سفپیم، مشخصنمودن مقاومت متقاطع[8] در بین ایزولهها، بررسی توانایی تولید آنزیم AmpC-beta-lactamase و شناسایی ژن blaCTX کدکننده آنزیم بتالاکتاماز با استفاده از روش PCR در ایزولهها بود.
روش تحقیق
در این مطالعه مقطعی که در طی یک سال-از فروردین تا اسفندماه سال 1393- انجام شد، نمونههای مختلف (خون، ادرار، خلط، زخم، تراشه) از بیماران بستری در بیمارستانهای فقیهی، قطبالدین و نمازی شیراز جمعآوری شد. برای هر یک از افراد مورد بررسی، پرسشنامه تنظیم و کدگذاری گردید. نمونهگیری از افراد، پس از مشخصنمودن هدف مطالعه برای آنها و کسب رضایت کتبی آگاهانه از هر یک از افراد تحت مطالعه، صورت پذیرفت.
جداسازی و شناسایی باکتری:
ابتدا نمونهها بر روی محیطهای معمول میکروبشناسی شامل: محیطهای بلاد آگار، شکلات آگار و مککانکی آگار (Merck Co. Germany) کشت داده شدند؛ سپس نمونهها در دمای 37درجه سانتیگراد بهمدت یک شبانهروز انکوباسیون شده و از نظر رشد باکتری و تشکیل کلونی بر روی محیطها مورد بررسی قرار گرفتند. باکتریهای گرم منفی ایزولهشده از نمونههای ارسالی، بهکمک تستهای مورفولوژی و بیوشیمیایی اولیه شامل: رنگآمیزی گرم، اکسیداز، کاتالاز و حرکت (Merck Co. Germany) و بهدنبال آن با استفاده از تستهای بیوشیمیایی تعبیهشده در سیستم API 20E اختصاصی انتروباکتریاسیهها و بهدست آوردن کد ارگانیسم و وارد نمودن کد در نرم افزار API، مورد شناسایی نهایی قرار گرفتند.
تعیین حساسیت ایزولهها به آنتیبیوتیکها:
در این مطالعه به کمک روش استاندارد دیسکدیفیوژن و بر اساس پروتکل ارائهشده توسط سازمان استاندارهای بالینی و آزمایشگاهی (CLSI 2014) (10) و استفاده از دیسکهای
8 آنتیبیوتیک (Rosco, Danish) شامل: سفوکسیتین (FOX، 30μg)، آمیکاسین (AMI، 30μg)، سیپروفلوکساسین (CIP، 5μg)، سفتازیدیم (CAZ، 30μg)، سفپیم (CPM، 30μg)، جنتامایسین (GM، 10μg)، ایمیپنم (IMP، 10μg) و کلیستین (CO، 10μg)، حساسیت آنتیبیوتیکی سویههای جداشده مورد مطالعه قرار گرفت. در این روش با استفاده از نرمالسالین، رقّت 5/0 مکفارلند از باکتری تهیه گردید. سپس کشت بر روی محیط مولرهینتون آگار انجام شد. پس از انکوباسیون محیطها در دمای 2±35 درجه سانتیگراد بهمدت 16 تا 18 ساعت، نتایج خوانده شدند.
شناسایی سویههای حساس وابسته به دوز:
برای شناسایی ایزولههای SDD بر اساس پروتکل CLSI(2014)، از روش استاندارد دیسکدیفیوژن استفاده شد. سویههایی که هاله عدم رشد 24-19 میلیمتر در اطراف دیسک سفپیم داشتند، بهعنوان SDD در نظر گرفته شدند.
شناسایی سویههای تولیدکننده AmpC-beta-lactamase با استفاده از تست فنوتیپی:
در این روش، از دیسکهای آنتیبیوتیکی سفوکسیتین (FOX، 30μg) و سفپیم (CPM، 30μg) استفاده شد. ایزولههایی که مقاوم به سفوکسیتین و حساس به سفپیم بودند، بهعنوان AmpC-beta-lactamase positive
در نظر گرفته شدند.
PCR Assay: