چکیده
زمینه و هدف: بر اساس مطالعات قبلی، گیاه Achillea millefolium دارای اثرات ضدّ التهابی و آنتیاکسیدانی است؛ ولی در مورد نقش محافظت نورونی عصاره الکلی این گیاه بر استحاله (دژنراسیون) نورونهای حرکتی نخاع متعاقب آسیب عصب محیطی سیاتیک، شواهدی وجود ندارد. این مطالعه با هدف بررسی اثرات محافظت نورونی عصاره الکلی این گیاه در موش صحرایی، طراحی و اجرا گردید.
روش تحقیق: این مطالعه تجربی، بر روی 30 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار به وزن 250-200 گرم انجام شد. موشها بهطور تصادفی به پنج گروه6 تایی شامل: گروه شاهد، گروه کمپرسیون و 3 گروه کمپرسیون+تزریق عصاره اتانولی گیاه با غلظتهای 50، 75 و mg/kg 100 (داخل صفاقی، هفتهای یکبار، 3 نوبت) تقسیم شدند. کمپرسیون عصب سیاتیک، با استفاده از پنس خونبند (قفل درجه 2) به مدت60 ثانیه انجام شد. پس از گذشت 28 روز، از قطعات L4-L5 و S1-S3 نخاع با روش پرفیوژن نمونهبرداری شد. تجزیه و تحلیل آماری دادهها با استفاده از نرمافزار SPSS (ویرایش 19) و با کمک آزمونهای آماری آنالیز واریانس یکطرفه و تعقیبی Tukey در سطح معنیداری 05/0P< انجام شد.
یافتهها: چگالی نورونهای آلفای شاخ قدامی نخاع، در گروه کمپرسیون نسبت به گروه شاهد کاهش معنیداری داشت (001/0P<). در گروههای دریافتکننده عصاره الکلی گیاه، چگالی نورونی بهطور معنیداری افزایش یافت (01/0P<) و بیشترین میزان چگالی نورونی در غلظت mg/kg100 مشاهده گردید.
نتیجهگیری: عصاره الکلی گیاه Achillea millefolium بهخوبی توانست نورونهای حرکتی آلفای شاخ قدامی نخاع را پس از کمپرسیون عصب سیاتیک، محافظت کند. این اثر محافظتکنندگی احتمالاً ناشی از ترکیبات آنتیاکسیدانی و ضدّ التهابی موجود در گیاه میباشد.
واژههای کلیدی: Achillea millefolium، عصاره الکلی (اتانولی)، استحاله عصبی، محافظت نورونی
مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی بیرجند. 1394؛ دوره22 (4): 340-348 .
دریافت: 06/03/1394 پذیرش: 06/10/1394
مقدمه
آسیبهای وارده به اعصاب محیطی باعث شروع یکسری وقایع آبشاری مربوط به تغییرات استحالهای سلولی و مولکولی در ناحیه آسیبدیده میشود. این تغییرات تحت عنوان استحاله (دژنراسیون) والرین نامیده میشود که بهصورت واکنشهای عقبگرد به جسم سلولی نورونها نیز کشیده میشود و باعث تورّم جسم سلولی، جابهجایی هسته به بخش محیطی و ناپدیدشدن اجسام نیسل میگردد. بلافاصله بعد از آسیب اعصاب محیطی، ورود کلسیم به سلولهای شوان اتفاق میافتد که باعث تکثیر اولیه این سلولها میگردد. سلولهای شوان نهتنها پوشش میلین آسیبدیده را تخریب میکنند، بلکه سلولهای مرده را هم از ناحیه آسیبدیده خارج میسازند. سلولهای شوان طی این مرحله فاگوسیتوز میلین، سیتوکینها و کموکینها را نیز ترشح میکنند که باعث جذب سلولهای ایمنی به ناحیه آسیبدیده میشود (1-3)؛ همچنین کلسیم، وارد آکسوپلاسم آکسونهای آسیبدیده میشود و در آنجا کالپین (Calpain) که یک پروتئاز لازم برای استحاله آکسون میباشد را فعال میکند. از طرفی ورود کلسیم در این مرحله در آکسون، برای تشکیل جوانههای جدید رشد نیز ضروری میباشد. بنابراین یک تعادل بسیار مناسب کلسیم برای بازسازی (رژنراسیون) عصبی، بسیار مؤثّر خواهد بود. به همین دلیل ممکن است مهارکنندههای کلسیم، رشد آکسون را تسریع نمایند (1، 4، 5).
در مرحله بعد، ماکروفاژها در محل آسیبدیده تجمع مییابند که بخشی از آنها بهعنوان ماکروفاژهای داخلی بافت بوده و بخش دیگر که جمعیّت عمده آنها را تشکیل میدهند، از گردش عمومی خون به ناحیه آسیبدیده نفوذ میکنند. آخرین سلولهای ایمنی که به ناحیه آسیبدیده نفوذ میکنند، لنفوسیتهای T هستند که سیتوکینهای پیشالتهابی و ضدّ التهابی را تولید میکنند. این سیتوکینها میتوانند عملکرد ماکروفاژها را افزایش دهند و یا اینکه مهار کنند (6، 7). بنابراین فرآیند التهاب در جریان آسیب عصبی، به جریان میافتد. مهمترین سلولهای دخیل در استحاله والرین، سلولهای شوان و ماکروفاژها میباشند که از طریق شبکه سیتوکینها با یکدیگر ارتباط برقرار نموده و فاگوسیتوز و آزادسازی فاکتورهای رشد عصبی را کنترل میکنند که زمینه را برای رژنراسیون ناحیه آسیبدیده فراهم میکنند.
گیاه بومادران گونه Achillea millefolium، یک گیاه آروماتیک دائمی و متعلّق به خانواده کامپوزیته میباشد. اثرات فارماکولوژیک و بیولوژیک متعددی نظیر اثرات: ضدّ اسپاسم، ضدّ ویروسی و ضدّ توموری برای این گیاه به اثبات رسیده است (8، 9). در برخی مطالعات، عصارههای این گیاه، اثرات محافظتکنندهای در برابر استرس اکسیداتیو و التهاب در بافتهایی نظیر کبد و معده نشان داده است؛ همچنین عصارههای آبی آن، پاسخهای التهابی و جراحات پوشش میلین را در آنسفالومیلیت خودایمنی تجربی، کاهش داده است (10-12).
آسیب اعصاب محیطی، حدود سهدرصد آسیبهای وارده به بیماران را تشکیل میدهند. این آسیبها به مقدار زیادی عملکرد فرد را تحت تأثیر قرار میدهند و مواردی مانند: عدم حس و عدم حرکت را به دنبال دارند. بنابراین لازم است تحقیقات گستردهای صورت گیرد تا مشخص شود چگونه میتوان پاسخهای التهابی را تحت تأثیر قرار داده و ترمیم عصب محیطی آسیبدیده را افزایش و عملکرد آن را بهبود بخشید. در مورد اثرات ضدّ التهابی، آنتیاکسیدانی و التیامبخش گیاه Achillea millefolium، گزارشهای متعددی وجود دارد؛ ولی نقش محافظت نورونی عصاره الکلی این گیاه مورد بررسی قرار نگرفته است (10-12). بنابراین هدف از این مطالعه تجربی، بررسی اثر محافظت نورونی عصاره اتانولی گیاه Achillea millefolium در برابر استحاله عقبگرد عصب سیاتیک بعد از کمپرسیون آن در موش صحرایی میباشد.
روش تحقیق
گیاه Achillea millefolium از مجموعه گلخانههای دانشگاه سیستان و بلوچستان در اواخر خردادماه 1392 جمعآوری و در سایه، خشک گردید. گونه گیاه بهوسیله متخصص گیاهشناسی گروه زیستشناسی دانشگاه سیستان و بلوچستان شناسایی گردید. نمونه هرباریومی گیاه با کد 1238، در هرباریوم دانشکده علوم دانشگاه سیستان و بلوچستان نگهداری میشود. برای تهیه عصاره اتانولی گیاه، مقدار 30گرم از ساقه، برگ و گلهای آن آسیاب شده و بههمراه 120 میلیلیتر اتانول، درون بشر ریخته شد. سپس بِِشر بهمدت 24ساعت با مگنت روی همزن قرار داده شد. آنگاه محلول حاصل، با استفاده از کاغذ صافی صاف شد و در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد خشک گردید.
در این مطالعه تجربی، از 30 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار با سن تقریبی حدود 10 هفته و وزن 200 تا 250 گرم استفاده شد. موشهای صحرایی تا زمان انجام آزمایش در شرایط نوری 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی و در درجه حرارت 22 تا 24 درجه سانتیگراد در محل نگهداری حیوانات دانشکده علوم دانشگاه سیستان و بلوچستان نگهداری شدند. حیوانات بهصورت تصادفی به پنجگروه 6تایی شامل گروههای: A (شاهد)، B (کمپرسیون)، C (کمپرسیون+عصاره اتانولی به میزان mg/kg 50)، D (کمپرسیون+عصاره اتانولی به میزان mg/kg 75) و گروه E (کمپرسیون+عصاره اتانولی به میزان mg/kg 100) تقسیم شدند ( 13).
برای جراحی عصب حیوانات، ابتدا بیهوشی با استفاده دیاتیلاتر و کتامین (mg/kg 60) القا شد. پس از بیهوشی، عصب سیاتیک پای راست در ناحیه سر استخوان ران، با استفاده از پنس خونبند (قفل درجه 2) بهمدت 60 ثانیه تحت فشار (کمپرسیون) قرار گرفت. آنگاه محل ضایعه، ضدّ عفونی و بخیه زده شد. گروه شاهد فقط تحت عمل جراحی یعنی برش پوست و عضلات ناحیه ران راست قرار گرفتند و عصب سیاتیک آنها تحت فشار قرار نگرفت. در گروههای آزمون در طول 28 روز، سه نوبت تزریق داخل صفاقی صورت گرفت. اولین تزریق بلافاصله بعد از انجام عمل کمپرسیون و تزریقهای دوم و سوم، هر هفته یکبار انجام شد. در گروههای شاهد و کمپرسیون نیز سرم فیزیولوژی بهصورت داخل صفاقی تزریق گردید. پس از 28روز از تاریخ کمپرسیون، برای تثبیت بافت نخاع، از روش پرفیوژن (فرمالین 10% نمکی به همراه نرمال سالین از طریق بطن چپ قلب) استفاده شد. سپس نمونهبرداری از قطعات نخاعی مربوط به عصب سیاتیک انجام گرفت؛ بدین منظور نخاع بهطور کامل تا انتهای دم اسب، از داخل ستون مهرهها خارج گردیده و از انتهای دم اسب بهاندازه 18میلیمتر قطع شد. پس از آن نمونهگیری از نخاع بهطول 8 میلیمتر صورت گرفت. این منطقه محدوده جسم سلولی نورونهای تشکیلدهنده عصب سیاتیک یعنی اعصاب L4-L5 و S1-S3 میباشد (14، 15).
نمونههای تهیهشده، درون محلول ثابتساز (فرمالین 10% نمکی) قرار گرفته و پس از آن وارد مراحل پاساژ بافتی شدند. مراحل پاساژ بافتی شامل سه مرحله: آبگیری از بافت با استفاده از الکل (با رقتهای 70، 80 و 90)، شفافسازی توسط بوتانل و آغشتگی با پارافین بود. سپس بهصورت سریالی با استفاده از میکروتوم، برشهای 7 میکرونی تهیه گردید و با آبی تولوئیدین و ائوزین رنگآمیزی شدند. با استفاده از دستگاه فتومیکروسکوپ (مدل الیمپوس، ساخت کشور ژاپن) ، از منطقه شاخ قدامی نخاع عکسبرداری صورت گرفت.
برای شمارش نورونی، از روش نمونهبرداری سیستماتیک تصادفی استفاده شد و برای شمارش نورونهای حرکتی آلفا، از روش دایسکتور استفاده گردید. پس از شمارش نورونها، دانسیته نورونی توسط فرمولND=ΣQ/Σ frame×V dissector محاسبه گردید. در این فرمول ΣQ مجموع نورونهای شمارش شده در یک نمونه، Σ frame مجموع دفعات نمونهبرداری شده و V disector حجم چهارچوب نمونهبرداری میباشد که برابر با A frame×H است. در این فرمول نیز A frame مساحت چهارچوب نمونهبرداری و H فاصله بین دو برش یا ضخامت هر برش میباشد (14، 15).
برای بررسی توزیع نرمال یا غیرنرمال دادهها، از آزمون کلموگروف- اسمیرنوف استفاده شد و فرض نرمالبودن دادهها در سطح 05/0α= (احتمال خطای 5درصد) پذیرفته شد. آزمون مذکور نشان داد توزیع دادهها در تمامی گروههای مورد مطالعه، نرمال بود (2/0P=). بنابراین دادهها پس از ورود به نرمافزار آماری SPSS (ویرایش 19)، با استفاده از آزمونهای آماری آنالیز واریانس یکطرفه و تعقیبی Tukey، مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند. مقادیر P کمتر از 05/0 بهعنوان سطح معنیداری در نظر گرفته شد.
یافتهها
این مطالعه روی شش گروه موش صحرایی با وزن 250-200 گرم و سن حدود 10 هفته انجام شد. میانگین و انحراف استاندارد شمارش نورونهای حرکتی آلفای شاخ قدامی نخاع در گروههای مختلف مورد مطالعه در جدول یک نشان داده شده است. چگالی (دانسیته) جسم سلولی نورونهای حرکتی آلفای شاخ قدامی نخاع در گروههای مختلف مورد مطالعه نشان داد که تعداد آنها در گروه کمپرسیون (17/39±6/666) نسبت به گروه شاهد (22/34±1754) بهطور معنیداری کاهش داشت (001/0P<) (جدول 1).
نتایج بهدست آمده نشان داد که تزریق داخل صفاقی عصاره الکلی گیاه Achillea millefolium بهخوبی توانسته است نورونهای حرکتی آلفای مورد مطالعه را محافظت نماید. میانگین و انحراف استاندارد نورونهای مذکور در دوز mg/kg50 نسبت به گروه کمپرسیون بهطور معنیداری افزایش داشت (01/0P<). همچنین چگالی نورونهای مورد مطالعه بین گروههای تیمار با دوز mg/kg75 و تیمار با mg/kg100 در مقایسه با گروه کمپرسیون نیز افزایش معنیداری نشان داد؛ بهطوریکه با افزایش میزان تزریق عصاره الکلی گیاه، میانگین محافظت نورونی افزایش داشت (01/0P<)(نمودار 1).
جدول 1- میانگین±انحراف استاندارد چگالی نورونهای حرکتی آلفای شاخ قدامی نخاع در گروههای مختلف مورد مطالعه و مقایسه گروههای مختلف تیمار با یکدیگر و گروه کمپرسیون.
گروه |
تراکم نورونی |
حداقل تراکم |
حداکثر تراکم |
گروه A (شاهد) |
22/34±1754 |
1690 |
1787 |
گروه ‍‍B (کمپرسیون) |
17/39±6/666 |
611 |
722 |
گروه C (کمپرسیون+تیمار به میزان mg/kg 50) |
72/69±1236 |
1167 |
1361 |
گروه D (کمپرسیون+تیمار به میزان mg/kg 75) |
17/39±3/1444 |
1389 |
1500 |
گروه E (کمپرسیون+تیمار به میزان mg/kg 100) |
39/57±3/1546 |
1472 |
1611 |
آزمون ANOVA نشاندهنده تفاوت آماری معنیداری بین گروههای تیمار با گروه کمپرسیون بود (001/0P<).